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目的:放疗是肝癌治疗过程中的重要环节之一,它能对癌细胞起到有力的杀伤作用,但是随着放疗次数的增多,可能会出现肿瘤病灶对放疗的敏感性逐渐降低,也就是所谓的“放疗抵抗”,它是肝癌患者放疗后期造成肿瘤治疗疗效不理想的主要因素之一,因此针对肝癌放疗过程中出现的放疗抵抗进行更为深入的潜在性研究,并能从中寻找出解决这一难题的方法则显得尤为重要。在此项研究中,我们试图探讨:1.放疗射线是否可促进早期生长因子(Egr-1)及自噬相关蛋白的表达。2.肝癌细胞能否通过自噬引起放疗抵抗的相关分子机制。3.Egr-1是否通过与自噬相关基因4B(Atg4B)结合从而调控自噬过程。总的来说,就是探明Egr-1在放疗时电离辐射促进肝癌细胞自噬过程,从而引起放疗抵抗这一过程的分子机制。此项研究成果能为能日后应用于临床并最终克服放疗抵抗这一难关提供相关科学理论基础。方法:1.Western blotting方法检测不同电离辐射条件下对肝癌细胞中早期转录因子Egr-1及自噬相关基因Atg-4b、p62及LC3蛋白表达情况的影响。2.用腺病毒DN-Egr-1竞争性抑制Egr-1后,应用CCK8法、克隆形成试验、Transwell试验检测经高能X射线照射后肝癌细胞存活能力、克隆形成能力及迁移能力的改变。3.用腺病毒DN-Egr-1竞争性抑制Egr-1后,Western blotting方法检测凋亡相关蛋白表达情况。4.Luciferase试验和CHIP(染色质免疫共沉淀)试验验证肝癌细胞中Egr-1与Atg-4b的结合并对Atg-4b表达的起到调控作用。5.应用自噬抑制剂3MA和氯喹抑制自噬,Western blotting及克隆形成试验检测过表达Egr-1的肝癌细胞凋亡相关蛋白的表达情况及细胞克隆形成能力。结果:1.以0、2、4、8Gy剂量分别照射HepG2和SMMC-7721细胞株,并检测Egr-1表达量,蛋白印迹技术结果显示Egr-1在8Gy照射量时表达量显著增高。2.用腺病毒空载体(Ad-GFP)和Ad-DN-Egr-1病毒分别感染SMMC-7721和HepG2细胞。相比于空白对照组,感染了Ad-DN-Egr-1的肝癌细胞经过8Gy的照射后细胞存活率显著降低。将SMMC-7721细胞暴露在8Gy强度的电离辐射下,72小时测得对照组细胞存活率74.9%,感染了Ad-DN-Egr-1试验组细胞存活率49.4%。同样的在HepG2细胞中存活率分别为61.3%和38.2%。3.克隆形成试验结果显示经8Gy剂量照射的感染了Ad-DN-Egr-1的肝癌细胞克隆形成能力相较于对照组明显下降,与此相反,transwell试验结果显示感染了Ad-DN-Egr-1的肝癌细胞迁移能力显著增强。4.8Gy照射剂量条件下,同时抑制Egr-1表达,SMMC-7721和HepG2细胞的蛋白免疫印记结果均显示抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量减少,而凋亡蛋白Bax和cleaved caspase-3的表达增加。5.Western blotting检测经放疗照射的肝癌细胞自噬相关蛋白水平变化。相比于未予射线处理组,射线处理组自噬标志性蛋白Atg4B,LC3II蛋白表达量增加,而自噬底层蛋白p62/SQSTM1表达量减少,尤其是在8Gy照射剂量时较为明显。6.使用自噬抑制剂3-MA和CQ封闭掉实验组细胞自噬过程,克隆形成试验结果可见,实验组HepG2和SMMC-7721细胞株,在相同的射线照射条件下,其增殖能力较未被抑制自噬的对照组细胞显著降低。同样的,Western blotting检测到使用自噬抑制剂CQ和3-MA组的实验组肝癌细胞Bcl-2表达量显著降低,而Bax和cleaved caspase-3表达量增加。7.Luciferase试验结果表明,经照射组荧光素酶活性显著增强,而用DN-Egr-1抑制Egr-1表达后荧光素酶活性显著降低;CHIP实验结果示,预测的Atg4B启动子区域的三个潜在结合位点均可与Egr-1结合,经照射,Egr-1的抗体可分别沉淀下Atg4B的三个启动子序列靶点。8.自噬抑制剂处理HepG2和SMMC-7721细胞,后过表达Egr-1,western结果显示肝癌细胞凋亡蛋白表达减少,克隆形成试验提示实验组肝癌细胞克隆形成能力较对照组提高。结论:(1)高能X射线照射可诱导肝癌细胞即刻产生大量Egr-1调控细胞自噬,从而导致放疗抵抗,而抑制Egr-1可部分逆转这一过程;(2)转录因子Egr-1可通过与自噬相关蛋白Atg4B的结合,调控肝癌细胞自噬过程的发生。