骨保护素蛋白对骨质疏松及血管钙化作用机制的研究

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目的: 1.探讨骨保护素蛋白(OPG)对骨质疏松及血管钙化的作用机制,从基础和临床角度证实骨保护素蛋白在这两种疾病发病中的作用以及相互关系;2. 探讨CYP1A1基因第7外显子中多态性位点与老年男性骨密度的关系。 方法:1.(1)收集来自2006年1月至2007年9月上海瑞金医院老年科门诊和住院患者;(2)提取外周血基因组DNA用于进行基因型检测;(3)同时测量入选者的骨密度(腰椎2~4前后位、髋关节、股骨颈、Wards三角、髋部整体)、颈动脉IMT值、各项生化指标。2.(1)由上海南方模式生物研究中心提供OPG基因剔除小鼠;(2)分离小鼠主动脉血管平滑肌细胞并进行原代培养,待大部分组织块长出细胞晕相接触时传代,实验用第3-8代细胞;(3)利用形态学及免疫荧光方法鉴定主动脉血管平滑肌细胞;(4)分组诱导血管平滑肌细胞钙化,并测定细胞钙沉积量及细胞碱性磷酸酶(AKP)活性。 结果:1.(1)上海地区男性OPG基因启动子区存在950T-C单核苷酸突变位点,按基因型分为三组(TT 型、TC型和CC型)。各组患者的一般情况以及临床相关指标无统计学差异,具有可比性;(2)950T-C位点基因分布频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律;(3)腰椎TT基因型组与TC及CC基因型组比较骨密度显著下降,但三组间颈动脉IMT无显著性统计学差异;2.(1)野生型小鼠与OPG基因敲除小鼠主动脉切片比较显示OPG-/-小鼠主动脉血管壁平滑肌层出现钙化斑块;(2)磷浓度1.4mmol/L的培养基培养OPG+/+细胞钙沉积很少;OPG-/-细胞钙沉积即出现明显增加;当磷浓度>2.0mmol/L时,细胞钙沉积随着培养时间的延长显著增加;(3)磷浓度1.4mmol/L的培养基培养,OPG+/+细胞ALP活性随时间变化很小,OPG-/-细胞ALP活性即出现明显增加;当磷浓度>2.0mmol/L时,细胞ALP活性随着培养时间的延长显著增加;在相同培养时间内,OPG-/-细胞ALP活性明显高于OPG+/+细胞;3.(1) CYP1A1基因A4889G多态性位点基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡,但未发现C4887A多态性位点的存在;(2)A4889G位点基因型AA/AG/GG三组间以及等位基因A/G两组间的一般情况及性激素水平无显著性差异。(3)GG基因型的男性与AG及AA型比较,腰椎2~4前后位、Ward’s三角及髋部整体等部位的骨密度显著降低(P<0.05);校正BMI之后差异仍然存在。 结论:1.OPG基因950T-C多态性位点与上海地区男性骨密度存在相关性,但与颈动脉超声IMT值无显著相关性;2.OPG在动脉钙化过程中具有保护性作用;3. CYP1A1基因A4889G多态性位点GG基因型携带者可能为骨质疏松的易患人群。
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