目的:慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）,是一种复杂和高度异质性的呼吸系统慢性疾病,有着较高的发病率及死亡率,给社会及经济均造成了巨大的负担。由于这一高度异质性,COPD包括了很多的表型,探索不同亚型的内部机制成为COPD的研究重点。急性加重是COPD自然病程中常见的、严重影响COPD预后及转归的关键性事件。与COPD非频繁急性加重表型患者对比,COPD频繁急性加重表型（定义为每年有两次以上中度急性发作或有一次重度急性加重需住院治疗）患者有着更严重的健康状况、不断升高的死亡率以及医疗保险的支出,因此COPD频繁急性加重表型更需要我们给予特别的关注。但目前对于这一表型的研究仍处于起步阶段,导致频繁急性加重表型易感性增加的病理生理机制仍不明确。有学者从有频繁急性加重倾向的COPD患者的肺泡灌洗液中提取了肺巨噬细胞,并应用脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）和干扰素-γ（interferon-γ,IFN-γ）刺激,发现这类患者肺巨噬细胞IL-6和IL-8的分泌减少,反应有频繁急性加重倾向的COPD患者肺巨噬细胞对外界的刺激有着更为明显的免疫应答功能障碍。本研究前期进行了COPD频繁急性加重表型蛋白组学的筛查,结果发现23个差异蛋白,其中包括有多配体蛋白聚糖（Syndecan-2,SDC2）,SDC2通过与多种配体相互作用,包括细胞外基质、细胞因子、趋化因子、生长因子和生长因子受体,参与慢性炎症形成的病理生理过程,并在其中发挥着关键的作用。因此,本研究基于前期频繁急性加重表型蛋白组学的研究结果,进一步通过体外细胞实验等方法,探讨在COPD频繁急性加重表型的发生发展过程中SDC2所发挥的作用机制。研究方法:第一部分:多配体蛋白聚糖2（SDC2）在COPD频繁急性加重表型表达水平的研究1)采用免疫荧光及免疫组化技术,确定SDC2在人肺组织的表达位置以及吸烟健康对照组（control）、COPD非频繁急性加重表型组（IFCOPD）及COPD频繁急性加重表型组（FCOPD）人肺组织的表达情况。2)采用Western Blot技术在蛋白质水平上检测Control组、IFCOPD组和FCOPD组人肺组织中的蛋白表达情况。3)采用q RT-PCR技术在m RNA水平检测Control组、IFCOPD组和FCOPD组在人肺组织中的表达情况。4)采用ELISA法验证SDC2是否存在COPD患者血清中,并比较Control组、IFCOPD组和FCOPD组人血清中的表达情况,通过绘制受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC）来分析SDC2作为生物标志物的准确性、特异性和灵敏度。第二部分:SDC2调控肺巨噬细胞接受LPS刺激时应答反应的研究使用佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA）与THP1单核细胞共孵育的方法诱导THP1分化为巨噬细胞。采用慢病毒转染和质粒转染技术,构建巨噬细胞中SDC2过表达和敲减的巨噬细胞模型,ELISA法检测细胞模型上清液中炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α表达情况,流式细胞术对细胞模型中的细胞进行M1、M2分型的筛选通过将巨噬细胞暴露于脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）,构建巨噬细胞中SDC2过表达和敲减时的体外炎症模型,ELISA法检测细胞模型上清液中炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α表达情况,流式细胞术对细胞模型中的细胞进行M1、M2分型的筛选第三部分:SDC2通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路调控巨噬细胞的功能1)通过LPS暴露,构建巨噬细胞的体外炎症模型,通过western blot技术检测不同浓度LPS刺激下SDC2蛋白表达水平及应用ELISA法检测细胞上清中IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α等炎症因子的表达情况。2)采用慢病毒转染和质粒转染技术,构建巨噬细胞中SDC2过表达和敲减的巨噬细胞模型,通过western blot及q RT-PCR技术检测TLR4、MyD88、NF-κB p65的蛋白及m RNA水平的表达情况;通过细胞免疫荧光技术、观察NF-κB p65核移位的情况。3)给予TLR4/MyD88阻断剂,明确NF-κB p65核移位及细胞上清炎症因子IL-6、IL-8的表达情况。结果:第一部分:多配体蛋白聚糖2（SDC2）在COPD频繁急性加重表型表达水平的研究1)采用免疫荧光和免疫组化技术,明确SDC2主要表达在肺巨噬细胞及细胞外基质内。2)通过Western Blot技术发现,与IFCOPD相比较,SDC2在FCOPD组肺组织中的蛋白表达下降。3)通过q RT-PCR技术发现,与IFCOPD相比较,SDC2 m RNA水平FCOPD肺组织中的表达量升高。4)通过ELISA法发现SDC2存在人血清标本中,与IFCOPD组相比,FCOPD组人血清标本中SDC2表达量下降。通过ROC曲线分析SDC2曲线下面积为0.65（p=0.09）,SDC2不适宜作为COPD亚型鉴别的生物标标志物应用。第二部分:SDC2调控肺巨噬细胞接受LPS刺激时应答反应的研究1)采用慢病毒转染和质粒转染技术,成功构建巨噬细胞中SDC2过表达和敲减的巨噬细胞模型。与SDC2敲减组对比,SDC2过表达巨噬细胞向M1型极化,SDC2过表达的巨噬细胞上清液中炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α表达升高,SDC2敲减组则未发生极化改变。2)采用LPS暴露,成功构建巨噬细胞中SDC2过表达和敲减时的体外炎症模型。与空载体对照组及SDC2敲减组对比,SDC2过表达组接受LPS刺激时巨噬细胞向M1型极化增多,SDC2敲减组巨噬细胞向M1型极化减少。SDC2过表达的巨噬细胞上清液中炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α表达明显升高,而SDC2敲减后的巨噬细胞炎症因子分泌明显下降;当SDC2敲减的巨噬细胞接受高浓度（1ug/m L）LPS刺激时炎症因子IL-6、IL-8的分泌仍明显低于SDC2过表达组接受低浓度（0.01ug/m L）LPS刺激时炎症因子的分泌。第三部分:SDC2通过TLR4/MyD88/NF-κB信号通路调控巨噬细胞的应答功能1)通过LPS暴露,成功构建巨噬细胞的体外炎症模型,结果发现LPS可以诱导巨噬细胞表达SDC2,且随LPS浓度的增加SDC2蛋白表达水平增加,细胞炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α表达增加。2)在巨噬细胞中SDC2过表达和敲减的细胞模型中,SDC2过表达组TLR4、MyD88蛋白及m RNA表达增加,而SDC2敲减组表达下降。SDC2过表达可见NF-κB p65的核内移。3)给予TLR4/MyD88阻断剂,抑制了NF-κB p65的核移位、细胞上清炎症因子IL-6、IL-8的表达下降。结论:1、SDC2表达在人肺巨噬细胞与细胞外基质内,相对于COPD非频繁急性加重表型组,SDC2蛋白水平在COPD频繁急性加重表型肺组织中表达下降;SDC2在COPD频繁急性加重表型患者血清中表达水平下降,但ROC工作曲线分析提示SDC2不适宜作为COPD表型鉴别的生物标志物。2、SDC2可以启动巨噬细胞向M1型极化,促使巨噬细胞分泌IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α等炎症因子,敲减SDC2则未诱导巨噬细胞的极化。巨噬细胞在接受LPS刺激时,SDC2可以增强巨噬细胞向M1型极化,炎症因子IL-6、IL-8、IL-1β及TNF-α分泌增加的应答反应,而敲减SDC2后降低了这一应答反应。3.LPS刺激可以诱导巨噬细胞SDC2蛋白的表达。过表达SDC2巨噬细胞TLR4、MyD88蛋白及m RNA水平上升,敲减SDC2的巨噬细胞TLR4、MyD88蛋白及m RNA水平下降,SDC2可能是TLR4/MyD88的上游分子。SDC2使巨噬细胞NF-κB p65由细胞质移向细胞核内,激活NF-κB通路。阻断TLR4/MyD88可以抑制SDC2引起的NF-κB p65核内移,减少巨噬细胞分泌炎症因子IL-6、IL-8。SDC2通过调控TLR4/MyD88/NF-κB通路启动和调控巨噬细胞的功能。