昆虫先天免疫通路通过免疫识别、免疫级联和免疫效应物发挥作用。家蚕作为一种重要的特种经济昆虫,在与微生物漫长的协同进化中,形成了较完善的一套先天免疫机制。先天免疫是由微生物的病原体模式识别分子（PAMPs）激活的,包括组成细菌细胞膜的肽聚糖和脂多糖,以及组成真菌细胞壁的甘露聚糖和β-葡聚糖等多糖。PAMPs被模式识别受体识别后激活免疫级联通路,释放免疫效应物发挥作用。血淋巴中存在大量的蛋白质,其中营养贮藏蛋白和蛋白酶抑制剂非常丰富。已有研究报道蛋白酶抑制剂在家蚕中具有抗真菌作用,Kazal型蛋白酶抑制剂（KPIs）在蜜蜂、水母、小龙虾等物种中有抗微生物的报道。2019年,本实验室利用蛋白质组学的方法对微生物诱导后的家蚕血淋巴中的蛋白组分上调情况进行了鉴定,发现Bm SPI65在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌诱导后显著上调。那么作为家蚕KPIs的Bm SPI65是否也具有抗微生物的功能呢?其参与家蚕免疫防御的分子机制又是如何呢?目前,还没有关于家蚕KPIs参与免疫防御的报道。本研究期望阐明Bm SPI65的生物学功能,及其在参与家蚕免疫防御中的分子机制。我们从Bm SPI65的结构活性、表达及分布特征、蛋白酶抑制活性、抗菌活性、微生物结合特性等方面进行了研究,获得的研究结果如下:1、Bm SPI65结构活性与理化性质分析利用生物信息学分析方法对Bm SPI65序列比对分析,发现Bm SPI65由3个的Kazal结构域组成,各结构域含有6个半胱氨酸,分别形成3对分子内二硫键。Bm SPI65具有信号肽,属于可分泌蛋白。根据Bm SPI65的ORF序列设计特异扩增引物进行PCR扩增,构建表达载体p ET28a-Bm SPI65并转入表达菌株BL（DE3）,小量表达检测结果显示Bm SPI65以可溶形式表达。重组蛋白经镍柱亲和层析及凝胶过滤层析后,获得高纯度重组蛋白Bm SPI65,并且制备抗体。非还原性电泳检测结果显示重组蛋白Bm SPI65形成多聚体,在家蚕血清中Bm SPI65趋向于以多聚体形式存在。通过圆二色光谱分析重组蛋白Bm SPI65的二级结构,结果显示Bm SPI65主要呈α-螺旋结构,且具有良好的热稳定性。利用q PCR技术对Bm SPI65的表达特征进行了分析,结果显示Bm SPI65在家蚕五龄第5天和第7天高量表达,且在血细胞中特异表达。2、Bm SPI65免疫功能研究利用q PCR以及Western blot等技术检测微生物诱导后Bm SPI65的表达特征,结果显示Bm SPI65在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母、球孢白僵菌诱导后,在血细胞和脂肪体中均显著上调。通过研究Bm SPI65的抗真菌活性,我们发现其显著抑制白色念珠菌、酿酒酵母和球孢白僵菌这三种真菌孢子的生长。同源建模的三维结构显示,Bm SPI65的3个Kazal结构域P1残基位于暴露的无规卷曲中,分别为Arg28,Tyr79,Arg136。蛋白酶抑制活性检测结果显示,Bm SPI65对胰蛋白酶、胰凝乳蛋酶、链蛋白酶、蛋白酶K有显著抑制活性。3、Bm SPI65参与家蚕免疫防御分子机制为检测Bm SPI65与真菌孢子的结合情况,利用免疫荧光定位观察,结果显示Bm SPI65结合于球孢白僵菌表面。但是PI染色结果显示Bm SPI65不能导致球孢白僵菌死亡。为研究Bm SPI65是否能与PAMPs结合,我们检测了Bm SPI65的PAMPs结合谱,结果显示Bm SPI65与组成细菌细胞膜的肽聚糖、脂多糖结合,与组成真菌细胞壁的β-葡聚糖结合但不能与甘露聚糖结合。表明Bm SPI65特异的PAMPs识别机制是一种自我保护机制,可以避免引起家蚕糖蛋白聚集。将Bm SPI65与PAMPs孵育后再加入真菌孢子,结果表明Bm SPI65结合真菌表面的β-葡聚糖从而促使真菌孢子聚集。为探究Bm SPI65是否参与了家蚕的细胞免疫,我们将Bm SPI65与琼脂糖颗粒交联后加入血细胞中孵育,模拟PAMPs与Bm SPI65的结合,结果表明Bm SPI65能促进血细胞的包囊及黑化反应,这一反应能被Bm SPI65抗体阻断。为研究Bm SPI65在细胞免疫中的功能,我们在体外添加Bm SPI65和真菌孢子至家蚕血细胞中,结果表明Bm SPI65能使血细胞聚集,其通过与真菌孢子和血细胞的结合介导结节形成,促进血细胞吞噬真菌孢子。