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本文旨在研究黄体期短期优饲对绵羊卵泡发育的影响及其调控机理。通过短期优饲对血浆和卵泡液中代谢信号物质、生殖激素浓度、血浆脂质代谢及卵泡颗粒细胞生殖相关基因表达影响,探讨短期优饲促卵泡发育的作用机理,并通过下丘脑-垂体-卵巢轴系转录组分析,揭示短期优饲影响卵泡发育的分子调控网络,为研究营养调控绵羊繁殖提供理论依据。试验包含4部分内容: 1绵羊黄体期短期优饲时间的确定 试验选取60只9-10月龄、体重40 kg左右的道寒杂交(道赛特公羊×小尾寒羊母羊)一代母羊,随机分为四组,15只/组。对照组试验期间饲喂基础日粮(DE11.72 MJ/d,DP79.71 g/d),试验组先饲喂基础日粮,在优饲期间饲喂试验日粮(DE18.75 MJ/d,DP108.44 g/d),优饲结束后恢复基础日粮。所有试验用羊进行同期发情处理(阴道埋置CIDR12 d,肌注PG0.1 mg两次),以埋栓日为第0d,试验组于埋栓的第2d、6d、8d分别饲喂试验日粮,优饲期分别为10d、6d、4d,于埋栓第12d优饲结束撤栓注射PG,于埋栓后第20 d,选择发情结束的羊,利用腹腔镜来检测黄体个数。记录补饲前、补饲后体重变化及排卵率,确定促排的最佳优饲时间。 结果表明:试验组平均体重增加但无显著差异(P>0.05);与对照组相比,优饲10d、6d、4d排卵率分别提高了75%,25%,0%。由此确定,发情前10d进行短期优饲,可作为后续优饲试验方案进行。 2黄体期短期优饲对绵羊卵泡发育及血浆相关指标的影响 选择60只体重40 kg左右的道寒杂交羊,随机分为试验组和对照组,每组30只。按短期优饲10d方案进行。优饲第1、2、4、6、8、10d每组随机选取5只羊,空腹颈静脉采血,收集血浆,备测生殖激素、代谢激素、脂质代谢。于埋栓后第13d,14d,15d,每组随机选取6只羊屠宰,取卵巢组织,按小卵泡(≤3.0 mm),中等卵泡(3.0-5.0 mm)和大卵泡(≥5.0 mm)分别收集卵泡液及颗粒细胞,备测生殖激素、代谢激素及基因的表达。 结果表明:短期优饲组小卵泡(<3.0 mm)数量极显著低于对照组;中等卵泡(3.0-5.0 mm)数量呈极显著上升;大卵泡(≥5.0 mm)数量在卵泡期后期呈极显著上升。中等卵泡和大卵泡中葡萄糖、胰岛素含量极显著升高,瘦素含量只在大卵泡中显著升高。而小卵泡液中FSH含量显著增加,LH含量大卵泡中极显著的增加,雌二醇(E2)浓度在大卵泡中极显著的高于小卵泡、中等卵泡。 血浆中葡萄糖、胰岛素和瘦素浓度显著升高,生殖激素在短期优饲期间,FSH、LH和雌激素平均水平差异不显著。血浆中胆固醇、游离脂肪酸浓度全期显著下降,高密度脂蛋白胆固醇浓度极显著增加,尿素氮浓度显著下降。表明黄体期短期优饲,有利于促进体内能量的正平衡,提高葡萄糖、胰岛素和瘦素的利用率和进入率,促进卵泡颗粒细胞的增殖分化速度。 3黄体期短期优饲对绵羊卵泡颗粒细胞相关基因表达的影响 取埋栓后第13 d,14d,15d屠宰的6只发情羊卵巢上分离得到小卵泡(≤3.0mm),中等卵泡(3.0-5.0 mm)和大卵泡(≥5.0 mm)的颗粒细胞进行qRT-PCR检测。 结果表明:黄体期短期优饲促进卵巢FSHR1和FSHR3 mRNA基因在小卵泡和中等卵泡中的极显著表达,各级卵泡中CYP17A1mRNA基因表达显著高表达(P<0.01),STAR和CYP19A1mRNA基因在大卵泡中高表达(P<0.01),同时LHR和ESR1的表达量极显著增加。中等卵泡和大卵泡中OB-R和IGF-1 mRNA基因在颗粒细胞中的表达极显著增加。表明黄体期短期优饲可通过调控颗粒细胞中FSHR不同剪接及类固醇调节基因的表达,且卵泡内旁分泌或自分泌因子基因的表达,从而调控卵泡发育。 4黄体期短期优饲对绵羊下丘脑-垂体-卵巢轴系转录组分析 于埋栓后第13d,14d,15d(即卵泡期前期、卵泡期中期、卵泡期后期)每组取3只发情羊的下丘脑(B)、垂体(P)、卵巢(O)组织,进行RNA-Seq测序。通过Illumina Hiseq4000测序方法,分析发情初期、中期、末期对照组与试验组下丘脑、垂体、卵巢组织中差异表达基因,来探讨营养对下丘脑-垂体-卵巢轴系调控卵泡发育的作用机理。 结果表明:共构建了18个RNA文库,总共获得33149868-57138286不等的reads,比对到参考基因组上29560138~52705150个reads,占总读数的89.17%~94.53%。共检测出54339个转录本,其中获得了19207个可匹配的表达基因,其中大于2000 bp的转录本占编码转录本的64.89%,为后续基因分析提供了充足的数据。 卵泡期间,黄体期短期优饲可通过钙离子信号、MAPK信号通路、胰岛素信号通路、孕酮介导的卵母细胞成熟等信号通路在下丘脑-垂体-卵巢轴系水平上调控卵泡发育,使更多的卵泡优势化并发育成熟; 通过下丘脑-垂体-卵巢性腺轴系对各组织3d共同表达的差异基因分析,筛选出一些与繁殖相关的基因如AGRP、LEPR、PRL, RERG、AKR1D1、IGF1、NLRP14、PRR11、EGR1等基因被显著富集,所有差异表达的基因均可能作为繁殖的候选基因,参与营养调控卵泡发育过程。