慢性病严重危害现代人类健康,其中由肥胖、糖尿病等导致的心血管疾病已成为全球疾病死亡的首要原因。研究指出,通过控制血管内皮细胞低水平炎症有利于降低心血管疾病发生的可能。然而,到目前为止,大多数研究主要使用高剂量的促炎因子,比如TNFα,来诱导血管内皮细胞炎症,其低水平细胞炎症模型的建立迫在眉睫。此外,中草药来源的天然产物因具有低毒且生物活性好等优势,已成为防治心血管疾病药物的重要来源。三叶青作为我国民间常用的中草药,具有清热解毒、消炎止痛等功效。本实验室前期已从三叶青根部和叶片中共鉴定到133种植物化学物,但具体哪种成分发挥强效抗炎作用及其机制有待研究。因此,本研究利用TNFα联合IL-17建立血管内皮细胞低水平炎症模型,并围绕RNA m6A修饰研究其在此低水平炎症发生中的重要作用;基于针对Keap1蛋白的分子对接技术从三叶青植物化学物库中初步筛选可能具有抗炎作用的候选活性物质;利用血管内皮细胞低水平炎症模型进一步确定强效抗炎成分;分别通过CCK8、qRT-PCR及Western blot等方法测定细胞活力、炎症相关因子的基因和蛋白表达,研究该活性成分抗炎的量效关系;通过HPLC-QqQ-MS技术检测该活性成分在血管内皮细胞中的摄取,明确其是否能以原型形式在细胞内累积;通过siRNA干扰以及细胞免疫荧光染色等技术探究该活性成分是否通过Nrf2发挥抗炎活性,并利用表面等离子共振技术揭示其与Keap1直接结合,进而靶向激活Nrf2的分子机制。主要的研究结果如下:1、细胞因子IL-17可协同放大低水平TNFα(1ng/mL)引起的血管内皮细胞而不是其他细胞(比如肝细胞)炎症损伤,具体表现为细胞活力降低及IL-1β和IL-6等炎症相关因子蛋白表达水平的上升,但此低水平炎症并不引起血管内皮细胞内ROS、MDA及羰基化蛋白等含量的增加,提示细胞没有发生氧化应激,这可能与HO1、NQO1等抗氧化因子表达的上调有关。此外,在低水平炎症下NF-κBp65蛋白的荧光强度及其磷酸化水平显著增加,提示NF-κB经典炎症通路被激活。有趣的是,低水平TNFα联合IL-17可上调甲基化酶METTL3的基因表达,而下调去甲基化酶FTO的基因表达,从而导致mRNA m6A甲基化程度的升高,进一步采用DAA抑制m6A甲基化则会降低IL-6、IL-1β等炎症相关因子的蛋白水平,提示除NF-κB信号通路外,mRNA m6A甲基化参与了TNFα联合IL-17诱导的血管内皮细胞低水平炎症。2、与Keap1蛋白的分子对接结果表明,三叶青根部中含量丰富的山柰酚芸香糖苷、异槲皮苷、芦丁以及叶片中的5-咖啡酰奎宁酸、牡荆苷、荭草苷在Keap1蛋白活性空腔内呈现明显的结合作用,并且结合能力均高于抗炎阳性对照白藜芦醇。进一步利用血管内皮细胞低水平炎症模型试验发现,6种候选植物化学物均能使得IL-6、IL-1β等炎症相关因子蛋白水平显著降低,其中牡荆苷的抗炎效果最强。进一步的量效关系研究表明,0-60 μmol/L的牡荆苷以剂量依赖方式缓解低水平炎症引起的细胞活力降低,炎症相关因子的基因、蛋白表达上调,以及NF-κB p65磷酸化水平升高。此外,牡荆苷在F-12K细胞培养基及HBSS缓冲液中均表现为很强的稳定性,其在12 h后的保留率达80%以上,而且我们在细胞内检测到呈浓度依赖性的高水平牡荆苷,表明其能以原型形式被血管内皮细胞吸收,进一步发挥抗炎活性。3、牡荆苷能显著上调细胞中总的Nrf2基因及蛋白表达,明显降低细胞质中Nrf2蛋白水平,同时提高细胞核中Nrf2蛋白水平。此外,Nrf2荧光强度在牡荆苷处理后也显著增加,且主要集中在细胞核内,提示牡荆苷可活化Nrf2。通过siRNA干扰技术沉默Nrf2基因,发现牡荆苷失去了降低ICAM、IL-6等炎症相关因子的基因和蛋白表达以及抑制NF-κB信号通路的能力,提示其通过Nrf2发挥抗炎活性。通过构建过表达载体得到高纯度Keap1蛋白,并采用表面等离子共振技术发现,牡荆苷与Keap1可发生强烈结合,亲和力常数为60μmol/L。因此,三叶青中的牡荆苷抗血管内皮细胞低水平炎症的分子机制为:通过与Keap1直接结合阻断Nrf2与Keap1的相互作用,促使Nrf2解离入核,进一步转录抑制炎症相关因子的表达,从而抑制炎症。