近年来，随着人们生活水平的提高以及生活习惯的改变，酗酒人数不断增多，酒精已成为继病毒性肝炎后导致肝损害的第二大病因。长期重度饮酒者中，90％以上有一定程度的脂肪肝。脂肪肝的最早表现是脂肪变性，同时伴随脂质代谢紊乱，如甘油三酯（Triglyceride，TC）的合成增加、脂肪输出减少以及肝外脂肪动员等。目前，关于酒精性脂肪肝(Alcoholic fatty liver，AFL)的免疫学机制研究备受关注，但是具体相关机制有待阐明。在AFL患者中，酒精通过各种途径导致巨噬细胞功能异常、氧化应激、脂肪组织的蓄积和肠道菌群的过度繁殖，进而刺激炎性细胞并释放各种炎症细胞因子，如肿瘤坏死因子-a(TNF-a)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)等，导致肝细胞损伤及肝脏炎性反应。目前关于酒精性脂肪肝(Alcoholic fatty liver，AFL)的治疗关键是戒酒。去除酒精影响因素后，脂肪变性可恢复正常。若防治不当，在脂肪出现异常变化过程中发生的脂质代谢紊乱可使肝细胞遭受损害。随着肝内脂肪堆积的增多，肝细胞损害也随之加重，肝脏罹患相关性疾病的风险就越高。所以，抑制AFL的形成对于防治肝脏疾病至关重要。河蚬盛产于日本北部本州青森县。当地居民长期食用高温煅烧后的河蚬壳粉(Fired Shell Powder, FSP)作为一种民间医药治疗肝脏疾病。最近，日本学者Sasaki等研究发现500℃高温煅烧下提取的FSP能够明显改善急性肝炎模型大鼠的肝功能，并且能通过增强NK细胞杀伤活性来促进肝脏的炎症吸收。关于FSP是否能够抑制酒精性脂肪肝的形成及其相关机制有待阐明。为此，本实验通过AFL模型小鼠，观察经FSP处理后，小鼠体内血脂、肝功能、肝组织内TNF-a、IL-6和IL-10的mRNA表达水平及脾细胞培养上清中TNF-a、IL-6和IL-10的含量的变化等情况，为证实FSP能够抑制AFL的形成及其相关机制提供理论和实验依据。　　 实验方法:　　 1、实验动物及主要试剂　　 6～8W清洁级雌性C57BL/6小鼠，购于上海中国科学院实验动物中心。　　 煅烧的贝壳粉（由日本弘前大学SASAKI教授惠赠），RPMI-1640培养液，标准胎牛血清，0.01M PBS缓冲液，红细胞裂解液，四甲基偶氮唑盐，胰蛋白酶，TNF-a、IL-6和IL-10ELISA试剂盒，RNA LA PCRrM Kit Ver.1.1等。　　 2、实验动物分组及处理　　 将C57BL/6小鼠随机分成3组：正常对照组(Controlgroup)8只，AFL组和AFL+FSP组各10只。AFL+FSP组每天上午9:00每只小鼠灌胃FSP悬液0.5ml，正常对照组和AFL组同法给予等量双蒸水；灌胃30min以后，AFL组和AFL+FSP组每只小鼠腹腔注射10％乙醇溶液1ml，正常对照组腹腔注射1ml生理盐水；连续处理14天。　　 3、样品的采集与指标检测　　 (1)血脂四项及肝功能的检测末次处理的次日，眼球取血，离心收集血清。利用全自动化分析仪测定小鼠血清总胆固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(High density lipoprotein cholesterol，HDLC)、低密度脂蛋白胆固醇(Low density lipoprotein cholesterol，LDLC)、血清谷草转氨酶(Glutamic oxaloacetic transaminase，GOT)、谷丙转氨酶(Glutamic pyruvic transaminase，GPT)和总胆红素(Total bilirubin，TBil)的产生水平。　　 (2)肝组织形态学观察迅速摘取小鼠肝脏，于肝右叶剪取0.5cm×0.5cm大小肝组织，4％多聚甲醛固定48h，制作石蜡切片。HE染色，光学显微镜下观察肝组织形态学改变。　　 (3)肝细胞悬液的制备及肝细胞存活率的测定通过胰蛋白酶冷消化法分离提取肝细胞，调整细胞浓度为1×107／ml。以1×106/ml浓度接种细胞培养板培养至不同时间点，利用MTS试剂盒测定各细胞培养孔内的OD492值，并计算肝细胞存活率。　　 (4)脾细胞分离及其悬液制备颈椎脱位处死小鼠，常规无菌制备脾细胞悬液，调整细胞浓度至1×107／ml。　　 (5)实时荧光定量(RealTime)PCR技术检测法检测肝组织内TNF-a、IL-6和IL-10mRNA的表达水平。　　 (6)双抗体夹心ELISA试剂盒分别检测各组小鼠脾细胞培养上清中TNF-a、IL-6和IL-10的分泌水平，酶标仪测定450nm处OD值。结果以试剂盒提供的标准品绘制标准曲线，应用SoftMax Pro4.3.1 Ls软件分析，计算细胞因子含量(pg/ml)。　　 (7)统计学处理采用SPSS16.0软件分析结果，数据以均数±标准差((-x)±s)表示，采用独立样本t检验进行组间比较。　　 实验结果:　　 1、FSP对实验小鼠血脂的影响　　 FSP处理C57BL/6小鼠后，小鼠血清中血脂的产生水平结果为：AFL组血清中TG、TC、HDLC和LDLC的水平均显著高于正常对照组(P值分别为＜0.01和＜0.05)。AFL+FSP组与AFL组比较，血清中TG和TC的水平显著下降(P＜0.05);HDLC水平下降，但未见统计学差异；LDLC的水平则显示升高(P＜0.05)。AFL+FSP组血清中HDLC的仍显著高于正常对照组(P＜0.05)。　　 2、FSP对小鼠肝功能的影响　　 FSP处理C57BL/6小鼠后，小鼠血清中肝功能的检测结果为：用FSP处理C57BL/6小鼠后，小鼠血清肝功能的检测结果为：AFL组血清中GOT、GPT和TBil水平均显著高于正常对照组(P值均＜0.01)。AFL+FSP组血清中GOT和GPT的水平较AFL组显著下降(P值分别为＜0.05和＜0.01)，但仍显著高于正常对照组(P值分别为＜0.05和＜0.01);TBil的水平不仅明显低于AFL组(P＜0.01)，而且基本降至正常对照组水平(P＞0.05)。　　 3、FSP对小鼠肝组织形态学的影响　　 组织切片HE染色可见，对照组小鼠肝小叶结构正常，肝细胞排列规则成条索状，在中央静脉周围呈放射状分布，肝细胞胞浆均匀，偏嗜酸性；AFL组小鼠肝小叶界限不清，肝细胞索排列紊乱，胞浆内可见大小不等、数量不一的微小脂滴空泡（脂肪变性）；AFL+FSP组的肝细胞排列较整齐，肝细胞内脂滴较少，脂肪变性比AFL组明显减轻。　　 4、FSP对小鼠肝细胞存活率的影响　　 利用MTS检测试剂盒测定各组肝细胞的存活率，从细胞培养至第6小时开始，每隔12小时作为一个细胞存活率的检测时间点，结果显示在84h内各时间点AFL+FSP组肝细胞存活率均高于AFL组。在此之后细胞存活率开始下降，提示在一定时间内FSP具有促进肝细胞增殖和维持肝细胞存活率的作用。　　 5、FSP对肝组织内TNF-a、IL-6和IL-10的mRNA表达水平影响　　 通过Real Time-PCR技术检测了小鼠肝组织内TNF-a、IL-6和IL-10的mRNA表达水平，结果为：AFL组与正常对照组比较，小鼠肝组织内TNF-a的mRNA表达水平有所升高，IL-6和IL-10的mRNA水平有所降低，但均未见统计学差异（P＞0.05）。AFL+FSP组与AFL组比较，TNF-a、IL-6和IL-10的mRNA表达水平分别有所下降和升高，但均未见统计学差异（P＞0.05）。AFL+FSP组TNF-a的mRNA表达水平较正常对照组也明显下降(P＜0.05)。　　 6、FSP对脾细胞培养上清中TNF-a、IL-6和IL-10含量的影响　　 经FSP处理后，利用ELISA法检测小鼠脾细胞培养上清中TNF-a、IL-6和IL-10含量，结果为：AFL组与正常对照组比较，TNF-a和IL-6的水平显著升高(P值均＜0.01)，IL-10水平也显示升高，但未见统计学差异(P＞0.05)。AFL+FSP组与AFL组比较，TNF-a的水平明显下降(P＜0.01)，可降至正常对照组所测得的水平；IL-6和IL-10的水平也显示下降，但未见统计学差异；AFL+FSP组IL-6水平仍明显高于正常对照组(P＜0.01)。　　 结论:　　 1、FSP能够降低酒精性脂肪肝小鼠体内血脂水平，改善受损肝功能。　　 2、FSP能够促进肝细胞增殖，使酒精损伤的肝组织形态得到明显改善。　　 3、FSP可以下调血清TNF-a和IL-6水平，从而遏制小鼠酒精性脂肪肝的发生和发展；对IL-10未产生明显影响。