鸡球虫病是由艾美耳球虫（Eimeria spp.）寄生于鸡肠道引起的一种寄生虫病,其病原有7种,常为混合感染。各种鸡球虫的流行病学、致病性、免疫原性以及对药物敏感性不尽一致。因此,对鸡球虫种类鉴定与流行病学调查有助于鸡球虫病的防控。鸡球虫种类鉴定的传统方法,主要根据卵囊形态、虫体寄生部位、眼观病变特征、潜在期等生物学特征,这不仅要饲养无球虫感染的雏鸡,而且鉴定过程费时费力。为此,本文根据鸡球虫核糖体DNA内转录间隔区1（ITS-1）序列设计7对种特异性引物,建立鉴定鸡球虫种类的单重PCR与多重PCR方法;构建球虫ITS-1重组质粒,以重组质粒DNA为球虫rDNA阳性标准品;最后用多重PCR方法对如东县20个养殖户的31个鸡群进行鸡球虫流行病学调查。本研究建立的方法为鸡球虫病的防控提供了技术手段。1.鸡球虫种类鉴定的单重PCR方法的建立根据GenBank中柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、堆型艾美耳球虫（E.acervulina）巨型艾美耳球虫（E.maxima）、早熟艾美耳球虫（E.praecox）、和缓艾美耳球虫（E.mitis）和布氏艾美耳球虫（E.brunetti）的ITS-1序列,设计7对种特异性引物,以7种鸡球虫的全基因组DNA为模板,分别进行PCR扩增,优化反应条件,建立7种球虫的单重PCR方法,并对其特异性和敏感性进行了研究。结果显示,每对引物均能扩增出特异性条带,其大小分别为278bp（柔嫩艾美耳球虫）、383bp（毒害艾美耳球虫）、476bp（堆型艾美耳球虫）、220bp（巨型艾美耳球虫）、390 bp（早熟艾美耳球虫）、350bp（和缓艾美耳球虫）和311 bp（布氏艾美耳球虫）,其最小检测浓度为0.01 ng。在刚地弓形虫、火鸡组织滴虫、住白细胞虫对照样本中均未扩增出任何条带,表明建立的方法具有很强特异性和较高敏感性。2.鸡球虫种类鉴定的多重PCR方法的建立在7种鸡球虫中,柔嫰、堆型和巨型艾美耳球虫在临床上最常见;柔嫰、毒害和布氏艾美耳球虫致病性大,均在盲肠中形成卵囊,且卵囊形态相似;早熟、和缓和堆型艾美耳球虫潜在期相近,卵囊形态相似。快速鉴别这些球虫种类,有助于鸡球虫病的准确诊断与防控。为此,应用上述鸡球虫虫种特异性引物,建立了能同时鉴定3种鸡球虫的多重PCR方法,并分别对其特异性和敏感性进行了研究。结果显示,每个多重PCR反应中的3对引物均能扩增出其特异性条带,其最小检测浓度为0.01 ng,其敏感性与单重PCR一致,在刚地弓形虫、火鸡组织滴虫、住白细胞虫对照样本中均未扩增出任何条带,表明建立的多重PCR方法具有很强特异性和较高敏感性。3.鸡球虫ITS-1序列重组质粒的构建及其在PCR检测中的应用纯化7种鸡球虫的单重PCR扩增产物,分别连接到pGEM-TEasy载体中,转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,经蓝白斑筛选及限制性酶切分析,获得含ITS-1序列的重组质粒;对重组质粒中插入的片段进行测序,用MegAgin 7.1.0软件进行序列分析,并采用邻位相连法（Neighbor-joiningmethod,NJ）构建系统发育进化树;分别以含鸡球虫ITS-1序列的重组质粒DNA为模板,对应已知球虫的卵囊DNA为阳性对照,用上述特异性引物进行PCR扩增,验证构建的7种鸡球虫重组质粒作为球虫rDNA阳性标准品的可能性。结果显示,柔嫩、毒害、巨型、堆型、早熟、和缓和布氏艾美耳球虫的ITS-1 片段大小分别为 278 bp、383 bp、220 bp、476 bp、390 bp、350 bp、311 bp,经系统发育进化树分析,均与GenBank中相应虫种处于同一分枝,表明重组质粒DNA可用作球虫rDNA 阳性标准品。4.多重PCR方法在鸡球虫流行病学调查中的初步应用采用饱和盐水漂浮法和多重PCR方法对如东县20个养殖户的31个鸡群进行鸡球虫种类调查。结果显示,饱和盐水漂浮法检查,65%（13/20）养殖户和64.5%（20/31）鸡群感染球虫;多重PCR检测,75%（15/20）养殖户和70.9%（22/31）鸡群感染球虫;共检测到7种球虫,柔嫩艾美耳球虫感染率为64.5%（20/31）,毒害艾美耳球虫为38.7%（12/31）,堆型艾美耳球虫为35.5%（11/31）,早熟艾美耳球虫为45.2%（14/31）,巨型耳艾美球虫为19.4%（6/31）,和缓艾美耳球虫为19.4%（6/31）,布氏艾美耳球虫为12.9%（4/31）;优势种为柔嫩艾美耳球虫;布氏艾美耳球虫感染率最低;球虫均为混合感染（100%）,混合感染2种球虫最多,为36.3%（8/22）。地面圈养鸡群的球虫感染率（80.0%）高于笼养（33.3%）。调查结果为该地区鸡球虫病有效防治提供了依据。