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苏云金杆菌或转基因植物产生的苏云金杆菌杀虫晶体蛋白毒素对靶标害虫毒杀能力很强,是一种非常重要的环境友好的生物农药,为植物提供了良好的保护作用。但是由于其广泛使用,实验室或田间的害虫已经产生了明显的抗性,这严重威胁着Bt资源的可持续利用。Bt毒素受体表达水平下降是昆虫产生抗性的重要机制之一。然而有关Bt毒素受体基因表达调控机制的研究极少。本项目主要研究了重要的转录因子FOXA对昆虫Bt毒素受体基因ABCC2和ABCC3的表达调控以及FOXA对昆虫细胞和昆虫虫体对毒素敏感性的调节。1棉铃虫中肠组织细胞系的建立及其对Bt毒素的敏感性鳞翅目昆虫中肠上皮细胞的刷状缘膜是Bt毒素作用的靶标。然而已经建立的昆虫中肠细胞系极少,大部分对Bt毒素不敏感,提示这些细胞系可能不或只能低水平表达Bt毒素受体基因。但是研究受体基因的表达调控需要高水平内源性表达受体基因的细胞系。因此我们建立了一株棉铃虫中肠组织细胞系并对该细胞系做了一系列的鉴定。HNU-Ha-MG1细胞的直径约13.8± 1.8μm,群体倍增时间为58.6±7.0 h,细胞形态呈圆形和梭形以及包含一些上皮样和成纤维样细胞,可能来源于中肠干细胞。脂酶同工酶分析、染色体核型分析和随机引物扩增分析结果表明该细胞系具有典型鳞翅目昆虫核型特征,与棉铃虫幼虫亲缘关系相近,不同于Tnh5和Sl-HP细胞系。20-羟基蜕皮酮诱导可使细胞发生凋亡而无明显自噬水平上升。虽然该细胞系对多种杆状病毒和Bt Cry1Ca毒素都敏感,但是对Bt Cry1Ac毒素不敏感。ABCC2和ABCC3都是Cry1Ac毒素的受体,研究这些受体基因的表达调控只能选用其他的细胞系。我们先前的实验表明斜纹夜细胞系Sl-HP可以高水平表达内源性的ABCC3基因,所以我们选用ABCC3基因的启动子和该细胞系继续开展Bt毒素受体基因表达调控的研究。2斜纹夜蛾ABCC3基因启动子的克隆与调控研究通过染色体步移,成功克隆了斜纹夜蛾ABCC3基因ORF上游2.5kb序列,用5’RACE的方法确定了 SlABCC3基因唯一的转录起始位点。通过在线网站预测分析,发现ABCC3启动子上具有了包括FOXA、FOXJ2、Kruppel和BR-C Z1等多个潜在的转录因子结合位点。本实验构建了全长启动子的荧光素酶报告基因重组质粒,采用荧光素酶报告基因检测系统检测了SlABCC3启动子在3种昆虫细胞系中的启动子活性。在全长启动子荧光素酶报告基因重组质粒的基础上,构建了一系列5’和3’截短启动子的重组质粒,并分别在Sl-HP和Sf9细胞中检测了各截短体的启动子活性。结果表明-1064nt区域的启动子活性达到最高,且并通过截短体的活性分析和顺式元件点突变等手段鉴定了 Kruppel(274nt～283nt)、FOXJ2(659nt～672nt)两个正调控的转录因子结合位点以及BR-C Z1(1267nt～1239nt)负调控的转录因子结合位点。3’端截短68bp后相对启动子活性显著下降证明了 5’UTR区域对于SlABCC3启动子活性是必须的。3棉铃虫ABCC2基因启动子的克隆与功能分析通过两种方法分别克隆了棉铃虫ABCC2启动子的全长序列,并通过在线软件对其进行了序列分析和顺式作用元件预测。结果如下:采用染色体步移和直接PCR扩增的方法,克隆得到HaABCC2基因ORF上游1.8kb序列,用5’RACE法确定了HaABCC 基因的转录起始位点。在线网站预测发现该启动子序列上含有2个潜在的Kruppel和17个潜在的FOXA的转录因子结合位点。这些结果表明鳞翅目昆虫ABCC2和ABCC3基因表达可能具有相似的调控机制。4转录因子对细胞和虫体对毒素敏感性的影响及其分子机制以上序列分析表明ABCC2和ABC,C3基因启动子上有多个潜在的FOXA结合位点,因此我们克隆了该基因,并研究了其对启动子活性和基因表达的调控。软件预测显示SlFOXA分子量为38.9 kDa,理论等电点为8.74,不稳定系数55.62,平均亲水性-0.731,两端有经典的核定位序列,预测定位在细胞核内。通过Swiss-Model软件同源建模显示FOXA的保守区域由两个翼(W1,W2),三个α螺旋(H1,H2,H3)和两个β-折叠(S1,S2)组成。蛋白质同源性比对显示FOXA具有极高的保守性,叉头框区域蛋白质序列高度一致。进化发育树分析表明SlFOXA与其他鳞翅目FOXA在同一簇。多种转录因子与SlABCC3启动子共转染发现,SlFOXA和HaFOXA均能显著提升ABCC3启动子在Sl-HP中的活性;而SlFoxj2,SlKruppel和Bm BR-C Z1对该启动子都不存在反式转录激活作用。在Sf9细胞中的结果类似。通过瞬时表达GFP融合的SlFOXA,观察表明FOXA在整个细胞有丝分裂间期都定位在细胞核,分裂期可与染色体共定位。采用实时荧光定量PCR的技术检测了超表达FOXA对BT受体基因在Sf9细胞内表达量的影响,发现ABCC2和ABCC3的表达量显著升高,分别约为对照组的2.2和3.7倍。超表达FOXA能显著提高Sf9细胞对Cry1Ac毒素的敏感性,5ug/ml毒素处理1h,约32%的总细胞发生病变(测得转染效率约为40-60%)。通过dsRNA干扰棉铃虫幼虫FOX4的表达,72 h检测到幼虫中肠内FOXA表达量下降了约55.7%,ABCC2和ABCC3的表达水平分别下降了 35.8%和48.8%,并且FOXA沉默的幼虫饲喂含有Cry1Ac毒素后比注射GFPdsRNA的对照组个体对Cry1Ac具有更强的耐受性,体重较重,死亡率显著降低。总之,本研究首次报道了先锋转录因子FOXA通过上调毒素受体基因的表达提高了昆虫细胞和昆虫幼虫对BT毒素的敏感性,提示FOXA基因的表达下调可能是一种潜在的昆虫对Bt毒素的抗性机制。