论文部分内容阅读
ABI5(AtDPBFs/ABFs)家族是一类亮氨酸拉链型转录因子。这类转录因子参与了植物种子胚胎发育晚期的基因表达调控以及ABA信号的传导。在拟南芥中,ABI5家族至少有八个成员,对这八个成员进行序列对位排列时发现了七个保守的区域。其中四个保守区域(Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅶ)的序列与一些激酶如CaMKⅡ/PKC/PKG和CK Ⅱ的磷酸化位点序列一致。保守区Ⅵ包含结合DNA的碱性区和单体聚合为二聚体的亮氨酸拉链区。为了解这些保守区的生物学功能,在对这一家族的一个最小成员-AtDPBF4进行了缺失分析和蛋白质与蛋白质相互作用分析。结果发现,在AtDPBF4中存在两个转录激活域—一个存在于邻近DNA结合域的、富含谷氨酰胺的、氨基酸序列不保守(在所有八个成员中氨基酸残基序列都无保守性)的区域；另一个即是保守区Ⅱ。保守区Ⅱ含有22个氨基酸残基,其共有序列为GKXXGSMNXDELLKXVLXXAEE,理论推测的二级结构以α-螺旋为主。当这一22个核苷酸残基的片段与Gal4的DNA结合域相连接后,即可在酵母细胞中激活报告基因的转录。由于AtDPBF4是来自植物的转录因子,其在酵母细胞中表现出来的转录激活活性是否在植物细胞中也如此尚不确定。此外,也未见与保守区Ⅱ序列类似的多肽在植物细胞中有转录激活活性的报道。因此,验证保守区Ⅱ在植物细胞中是否有转录激活活性就十分必要。本论文以植物基因瞬间表达分析方法为手段,通过构建植物瞬间表达载体系统,以期确定ABI5家族的保守区Ⅱ是否能在植物细胞中激活转录。同时,也为在植物细胞中进一步研究保守区Ⅱ的激活和调控机理奠定基础。本论文的主要工作摘要如下：1.效应基因载体的构建：以pUC19质粒为起始框架,以pCAMBIA1301为模板DNA进行缺失扩增,获得了缺失GUS基因的35SPro-NOSTer片段。该片段经EcoRI和HindⅢ肖化后插入到了同样两种限制性内切酶消化的pUC19质粒中,得到重组质粒pUC19-35SPro-NOSTer。以含有AtDPBF4保守区Ⅱ的p4Ⅱ质粒DNA为模板,从其中扩增并获得了含GAL4DBD与AtDPBF4Ⅱ的融合片段GAL4DBD-Ⅱ.该扩增片段经XbaⅠ和BamHI消化后插入到了同样两种酶消化的上述重组质粒pUC19-35SPro-NOSTer中(在35SPro的下游,NOSTer的上游)。最终获得了在35S启动子控制下的、含有GAL4的DNA结合域和AtDPBF4的保守区Ⅱ的融合多肽的效应载体pHQEff-6。核苷酸序列分析正确后大量制备该效应质粒用于基因瞬间表达分析实验。2.报告基因载体的构建：以pUC19质粒为起始框架,以pCAMBIA1301质粒为模板DNA进行扩增,获得了Mini35S-GUS-NOSTer片段。该片段经XbaⅠ和HindⅢ消化后插入到了经同样两种限制性内切酶消化的pUC19质粒中,得到重组质粒pUC19-Mini35S-GUS-NOSTer.根据UASG的序列设计了两条序列互补、末端粘性(XbaⅠ)的寡核苷酸。该两寡核昔酸片段经变性、复性得到3×UAS。片段,经EcoRI和BamH两种酶消化后插入到了同样两种酶消化的pUC19Mini35S-GUS-NOSTer中(在Mini35S的上游),得到3聚报告基因载体pHQRep(3×)。3×UASG片段进行磷酸化处理后插入经Xbal酶切并去磷酸化的pHQRep(3X)载体(在Mini35S上游,3×UASG下游),最终获得了6聚报告基因载体pHQRep-1(6X)。核苷酸序列分析正确后大量制备这两个报告载体用于基因瞬间表达分析实验。3.拟南芥原生质体的制备及转化：将拟南芥叶片切成0.5-lmm细条并置于酶解液中,0.05MPa真空渗透40min后,于黑暗条件25℃酶解4h。过滤并沉淀原生质体,调节原生质体浓度至2×105个/ml。取15μ g的效应载体和15μg的报告载体与100μl原生质体混匀,并加入终浓度为20%的PEG4000,室温转化15min。离心沉淀原生质体,用lml WI溶液重悬原生质体,将重悬的原生质体转移至培养皿中,诱导表达过夜。4.AtDPBF4保守区Ⅱ的转录激活活性测定：建立了3组共转化瞬间表达分析实验,对照组(pHQEff-6和pUC19-Mini35S-GUS-NOSTer),3聚组[pHQEff-6和pHQRep(3X)]及6聚组[pHQEff-6和pHQRep-1(6X)]。GUS活性测定结果分别为：11.81nmol4-MU·mg-1·min-1(对照组),46.53nmol4-MU·mg-1·min-1(3聚组),47.83nmol4-MU·mg-1·min-1(6聚组)。这一结果表明,AtDPBF4的保守区Ⅱ可在拟南芥细胞中激活下游基因(6US)的转录,这一结果与在酵母细胞中所得到的结果完全一致。