目的:全球范围内，估计有数以百万计的工人暴露于矽尘环境。这其中许多人接触到的矽尘浓度都高于职业暴露限值。矽尘进入肺组织导致矽肺病，矽肺是尘肺的一种，它是一种渐进性职业性肺疾病。其特点是慢性肺部炎症和不可逆的肺组织弥漫性纤维化。可导致患者失去劳动能力甚至死亡，给社会造成沉重负担。矽肺发病机制尚未完全阐明，临床缺乏特效治疗方法。因此寻找矽尘导致肺纤维化进程中的关键分子，将其作为特异性分子靶点并探明其作用和机制将为肺纤维化疾病的治疗和诊断提供新线索。我们使用蛋白芯片技术观察矽肺模型小鼠不同时期肺组织中蛋白表达谱的变化，选择差异表达最明显的4-1BB蛋白进行深入研究。探讨其在矽尘导致肺组织纤维化中的可能作用机制，将为肺纤维化治疗提供潜在靶标。　　研究方法:本研究以实验性矽肺模型小鼠为研究对象。通过气管非暴露式灌注二氧化硅悬液，构建矽尘诱导小鼠肺纤维化动物模型。利用蛋白芯片筛查实验，对矽尘暴露早期（7天）和晚期（56天）小鼠肺组织蛋白进行筛查实验;得到肺组织差异变化蛋白表达谱;得出矽尘暴露小鼠肺组织中4-1BB蛋白差异表达明显。使用ELISA、Western blot、qRT-PCR、免疫组织化学等实验方法进一步验证4-1BB蛋白表达情况;通过生物信息学分析和通路分析得到与4-1BB蛋白相关的信号通路;选取通路中关键蛋白为靶点，阻断4-1BB信号通路。使用H&E染色观察阻断信号通路对矽尘导致肺部炎症的影响;使用Masson染色和羟脯胺酸测定，观察阻断信号通路对矽尘导致肺组织纤维化的影响;通过Western blot方法检测信号通路阻断情况;采用ELISA和CBA技术检测各组小鼠肺泡灌洗液中相关炎性因子和小鼠肺组织蛋白中相关趋化因子的表达情况;通过流式细胞术检测各组小鼠肺门淋巴结中T细胞分型情况及小鼠肺组织中循环纤维细胞聚集情况。应用qRT-PCR方法检测小鼠肺组织中Th细胞免疫相关mRNA表达情况。　　给予矽尘暴露小鼠不同剂量的薯蓣皂苷，应用Masson染色观察薯蓣皂苷对于矽尘导致肺组织纤维化的影响;使用羟脯胺酸测定、western blot(Collagen-Ⅰ、FN-1)、qRT-PCR(Col-1、Fn-1)和免疫组织化学方法(Collagen-Ⅰ)确定薯蓣皂苷对矽尘导致肺组织纤维化的影响;通过H&E染色观察薯蓣皂苷对矽尘导致肺部炎症的影响，应用免疫荧光和免疫组织化学方法检测薯蓣皂苷对于矽尘导致的肺部巨噬细胞、B淋巴细胞和T淋巴细胞聚集的影响;应用ELISA和CBA技术检测小鼠肺泡灌洗液中相关细胞因子的含量。通过流式细胞术检测各组小鼠肺门淋巴结中不同类型辅助型T细胞所占比例及小鼠肺组织中循环纤维细胞聚集情况。使用qRT-PCR方法检测小鼠肺组织中Th细胞免疫和循环纤维细胞相关趋化因子mRNA表达情况。　　结果:　　1、矽尘暴露小鼠肺组织中4-1BB蛋白表达增高。　　与对照组相比，矽尘暴露小鼠肺组织中4-1BB蛋白表达增高。其中暴露后7天4-1BB蛋白表达增加770.86倍，暴露后56天4-1BB蛋白表达升高81.65倍。ELISA、western blot技术、qRT-PCR和免疫组化检测肺组织中4-1BB蛋白含量和mRNA表达情况，确定4-1BB在矽尘暴露组小鼠肺组织中高表达(p＜0.05)。　　2、4-1BB融合蛋白阻断4-1BB信号通路使ASK-1的磷酸化水平降低，NQDI1可以有效阻断矽尘导致的肺部4-1BB信号通路激活。　　通过体内体外实验证明，给予矽尘暴露小鼠4-1BB融合蛋白，可以降低小鼠肺组织中ASK-1的磷酸化水平，并呈现剂量反应关系(p＜0.05)。给予实验动物NQDI1可以阻断4-1BB信号通路，使信号通路下游蛋白p38和JNK的磷酸化水平下降，并且不影响实验小鼠血清中AST、ALT含量。　　3、阻断4-1BB信号通路可以减轻矽尘导致的肺部炎症和纤维化。　　使用ASK-1特异性抑制剂阻断4-1BB信号通路后，矽尘暴露导致的肺部炎症明显减轻。阻断4-1BB信号通路可以使矽尘暴露导致的肺组织炎性细胞浸润减轻，使小鼠肺泡灌洗液中炎性因子TNF-α含量降低(p＜0.05)，而IL-6，IL-1β的含量不受影响。随着疾病的进展，Masson染色显示矽尘暴露晚期（56天）模型组小鼠肺组织出现细胞结节和胶原沉积。阻断4-1BB信号通路可使矽尘暴露导致的肺纤维化减轻。羟脯胺酸含量测定和qRT-PCR(Col-1a1)结果进一步证明阻断4-1BB信号通路可使矽尘暴露导致的肺纤维化减轻(p＜0.05)。　　4、阻断4-1BB信号通路可以影响肺部Th免疫应答。　　在炎症早期，阻断4-1BB信号通路可以使肺门淋巴结中Th1细胞占CD4+细胞的比例显著降低(p＜0.05)。Th1细胞转录因子T-bet的mRNA水平降低(p＜0.05)，小鼠肺泡灌洗液中IFN-γ的含量降低(p＜0.05)。矽尘暴露晚期，阻断4-1BB信号通路可以使矽尘暴露小鼠肺组织中GATA3 mRNA水平降低(p＜0.05)。ELISA检测结果显示小鼠肺泡灌洗液中IL-13的含量有所下降，但差异不存在统计学差异。IL-4水平并没有因阻断4-1BB信号通路而改变。与矽尘暴露组相比，阻断4-1BB信号通路可以使小鼠肺门淋巴结中Th17细胞占CD4+细胞的比例降低(p＜0.05); Realtime-PCR检测Th17细胞转录因子ROR-γ T的mRNA水平也因阻断4-1BB信号通路而下降(p＜0.05); ELISA检测结果显示小鼠肺泡灌洗液中IL-17A的含量下降(p＜0.05)。矽尘暴露小鼠肺门淋巴结中调节性T细胞占CD4+细胞的比例升高(p＜0.05)。阻断4-1BB信号通路使调节性T细胞所占的比例下降(p＜0.05); CBA检测结果显示阻断4-1BB信号通路后第3天和第7天小鼠肺泡灌洗液中IL-10含量没有显著变化，而在第56天有明显下降(p＜0.05)。Realtime-PCR结果表明，阻断4-1BB信号通路后第7天和第56天小鼠肺部TGF-β mRNA水平显著下降(p＜0.05)。　　5、阻断4-1BB信号通路后纤维化减轻与循环纤维细胞向肺部聚集减少有关，相关趋化因子表达降低导致循环纤维细胞聚集减少。　　流式细胞术结果显示阻断4-1BB信号通路后，循环纤维细胞占肺组织细胞的比例下降(p＜0.05)。Realtime-PCR结果显示矽尘暴露后小鼠肺组织中VCAM-1mRNA水平较对照组明显上调(p＜0.05)，而ICAM-1的mRNA水平仅在矽尘暴露后7天显著上调(p＜0.05)，而阻断4-1BB信号通路并不能改变小鼠肺组织中两分子mRNA水平。ELISA检测肺组织中相关趋化因子的结果显示矽尘暴露组小鼠与对照组小鼠相比，CCL-2、CCL-12和CCL-21显著增高，而阻断4-1BB信号通路后，这些趋化因子的含量均有所下降(p＜0.05)。阻断信号通路也可以使SDF-1α的表达下降，但这种变化仅在第3天和第56天存在统计学差异。　　6、薯蓣皂苷可以减轻矽尘导致的肺部炎症和纤维化。　　羟脯氨酸含量测定结果显示，给予薯蓣皂苷的矽尘暴露组小鼠较矽尘暴露组小鼠肺组织中胶原沉积明显降低(p＜0.05)。各组小鼠肺组织石蜡切片进行Masson三色染色结果显示给予矽尘暴露小鼠薯蓣皂苷可以降低其肺部胶原沉积。Western blot结果显示，给予薯蓣皂苷的矽尘暴露组小鼠较矽尘暴露组小鼠肺组织中Ⅰ型胶原蛋白和纤连蛋白水平有所下降(p＜0.05)。qRT-PCR结果显示给予薯蓣皂苷的矽尘暴露组小鼠肺组织中Col-1a1和Fn-1 mRNA水平下降(p＜0.05)。免疫组织化学染色结果表明Ⅰ型胶原蛋白在小鼠肺组织中的沉积随给予薯蓣皂苷剂量的增加而减少(p＜0.05)。　　7、薯蓣皂苷可以减轻矽尘导致的肺部炎细胞的聚集。　　H&E染色结果显示，矽尘暴露组小鼠表现出严重的肺部炎症，而在给予薯蓣皂苷治疗后肺部炎症反应减轻，并呈现剂量反应关系。ELISA和CBA方法检测肺泡灌洗液中IL-6、IL-1β和TNF-α含量，发现与矽尘暴露组相比，给予薯蓣皂苷治疗的矽尘暴露组小鼠肺泡灌洗液中相关促炎因子含量减少，变化与给予薯蓣皂的剂量存在剂量反应关系(p＜0.05)。qRT-PCR结果表明小鼠肺组织中IL-6、IL-1β、TNF-α mRNA水平变化与之前ELISA检测结果趋势相一致。免疫荧光染色检测发现，矽尘暴露组小鼠肺组织切片中存在大量巨噬细胞聚集，而给予薯蓣皂苷使巨噬细胞的数量显著下降。qRT-PCR结果显示，给予高剂量(80 mg/kg)薯蓣皂苷的矽尘暴露组小鼠肺组织中CD68 mRNA水平明显降低(p＜0.05)。免疫荧光结果显示，矽尘暴露肺组织中B淋巴细胞(B220+)数量明显增加，给予薯蓣皂苷治疗后矽尘暴露导致的B细胞聚集有所降低。免疫组化结果显示矽尘暴露的肺组织中T细胞聚集增加，薯蓣皂苷治疗后T细胞聚集减少。　　8、薯蓣皂苷可以调节矽尘诱导的肺部Th免疫应答。　　流式细胞术检测显示，矽尘暴露组和对照组相较，肺门淋巴结中Th1和Th17细胞占CD4+T细胞比例显著增加，给予高剂量薯蓣皂苷后Th1细胞和Th17细胞比例有所下降。ELISA检测肺泡灌洗液中相关炎性因子含量，结果表明给予薯蓣皂苷可以使矽尘暴露早期Th1型细胞因子IL-2和IFN-γ含量降低(p＜0.05)，并可抑制Th2型细胞因子IL-4和IL-13的表达(p＜0.05)。qRT-PCR检测结果显示薯蓣皂苷可以使肺组织中Th1和Th2型细胞转录因子T-bet和GATA3 mRNA水平降低(p＜0.05)。ELISA检测表明与单纯矽尘暴露组相比，给予薯蓣皂苷治疗的矽尘暴露小鼠肺泡灌洗液中IL-17含量有所下降(p＜0.05)。　　9、薯蓣皂苷的抗纤维化作用与循环纤维细胞向肺组织聚集减少有关。　　免疫荧光结果显示矽尘暴露组小鼠肺组织中有较多循环纤维细胞聚集，给予薯蓣皂苷可以明显减少矽尘暴露导致的循环纤维细胞聚集。流式细胞术结果显示矽尘暴露可以导致肺部循环纤维细胞聚集增加，而给予薯蓣皂苷可以使其聚集减少。qRT-PCR结果显示给予薯蓣皂苷可以使肺组织中CCL12和CCL19 mRNA水平降低(p＜0.05)，而不能改变CCL21和CXCL12 mRNA水平。　　10、薯蓣皂苷通过调控TGF-β-Smad3信号通路减轻矽尘对肺泡上皮细胞的损伤。　　H&E染色结果显示，矽尘暴露组小鼠给予薯蓣皂苷7天后，肺组织结构损伤明显减轻。流式细胞术结果表明，肺组织矽尘暴露后EpCAM+FSP-1+双阳细胞数量明显增多，给予薯蓣皂苷治疗使这部分双阳性细胞数量明显减少(p＜0.05)。qRT-PCR分析发现矽尘暴露组小鼠肺组织中上皮细胞标记物Occludin(Ocln)、E-Cadherin(Cdh1)和Sf tpc mRNA水平较对照组明显下降(p＜0.05)，而间质细胞标记物Vimentin(Vim)和FSP-1 mRNA表达水平明显上升(p＜0.05);免疫荧光染色结果显示矽尘暴露导致肺组织上皮细胞标志E-cadherin表达减弱，而薯蓣皂苷治疗可以恢复矽尘导致的上皮细胞标记的损失。矽尘暴露小鼠肺组织中N-cadherin表达升高，给予薯蓣皂苷可以抑制其表达升高。Western Blot检测结果显示矽尘暴露小鼠肺组织中Vimentin的表达升高，而给予薯蓣皂苷可以剂量依赖性的减少其表达。　　qRT-PCR结果表明薯蓣皂苷处理能够降低矽尘暴露小鼠肺组织中Tgfβ mRNA水平(p＜0.05)。Western blot结果显示矽尘暴露小鼠肺组织蛋白中TGF-β表达升高，给予薯蓣皂苷可以降低其表达。Western blot结果显示薯蓣皂苷处理可以抑制矽尘诱导的肺部Smad3磷酸化，而不影响总Samd3水平。　　流式细胞分析结果显示矽尘暴露组小鼠肺门淋巴结中调节性T细胞比例较对照组明显升高(p＜0.05)，薯蓣皂苷治疗可以降低其比例(p＜0.05)。qRT-PCR结果显示薯蓣皂苷处理可以明显降低矽尘暴露组小鼠肺组织中IL-10和Foxp3mRNA水平(p＜0.05)。　　结论:1、矽尘暴露小鼠肺组织中4-1BB蛋白表达增高。2、阻断4-1BB信号通路可以减轻矽尘导致的肺部炎症和纤维化。3、阻断4-1BB信号通路可以减轻肺部Th免疫应答和循环纤维细胞向肺部的聚集进而减轻肺纤维化。4、薯蓣皂苷通过减少巨噬细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞向肺部的聚集，减轻肺部炎症。5、薯蓣皂苷通过调节肺部Th免疫应答、减少循环纤维细胞向肺部的聚集以及减轻矽尘颗粒对肺泡上皮的损伤，减轻肺组织纤维化。