在长期的进化过程中,昆虫形成了高度灵敏的嗅觉系统,并以此来感受外界环境中的气味物质,从而做出相应的行为或生理反应,如寻找配偶、食物和栖息场所等。昆虫的嗅觉分为外周和中枢神经感受两个过程,在外周神经感受过程中,气味结合蛋白(Odorant binding protein, OBP)和化学感受蛋白(Chemosensory protein, CSP)主要负责将进入到感器腔内的脂溶性气味物质结合并运输到位于感受神经膜上的气味受体(Odorant receptor, OR),因此在嗅觉中起重要作用。二化螟Chilo suppressalis (Walker)与褐飞虱Nilaparvata lugens (Stal)分属鳞翅目和半翅目,均是重要的水稻害虫,对其气味结合相关蛋白的研究,不仅有助于深入理解不同目昆虫的嗅觉机制差异,而且可以为开发高效的行为调控技术提供新的靶标基因,提高两种害虫的可持续防治水平。然而,相关研究很少,目前仅在转录组数据的分析、触角电位等方面有个别报道。本研究利用二化螟基因组/转录组与褐飞虱转录组数据,通过生物信息学和分子生物学相结合的方法,得到18个二化螟气味结合蛋白(OBP)基因和9个褐飞虱化学感受蛋白(CSP)基因的cDNA序列,其中15个二化螟OBP基因和9个褐飞虱CSP基因为cDNA全长序列。在此基础上,通过RT-PCR与qPCR技术,测定了这些基因在mRNA水平上的的组织和时间表达动态,并利用体外结合实验技术探讨了二化螟OBP8的生理功能。研究结果为明确两种水稻害虫化感基因的多样性及其生理功能奠定了基础。1.二化螟OBP基因的克隆及序列分析结合基因组数据分析并利用PCR技术,获得了18个OBP基因的cDNA序列,其中10个为全长序列,分别为CsupOBP3、CsupOBP8、CsupOBP9、CsupOBP11、 CsupOBP16、CsupOBP25、CsupOBP26、CsupOBP30、CsupOBP32和CsupOBP33。其中,CsupOBP3、CsupOBP16、CsupOBP23、CsupOBP26这4个基因只有4个保守的半胱氨酸位点,属Minus-C OBP。通过与其它鳞翅目昆虫OBP的氨基酸序列的进行比对发现,18个二化螟OBP序列与其它鳞翅目昆虫OBP有较高的一致性(Identity)。其中,CsupOBP9、CsupOBP23和CsupOBP24与其他基因的的最高一致性分别为43%、43%、41%,其它二化螟OBP基因与其它鳞翅目昆虫OBP的一致性均大于50%,尤其是CsupOBP11、CsupOBP32分别达到82%、79%。系统进化分析发现,二化螟CsupPBP4与其它鳞翅目昆虫的PBP聚于同一分支。2.二化螟OBP基因的时间和组织表达动态利用RT-PCR技术,检测了二化螟30个OBP基因在幼虫不同龄期头部及身体、雌雄蛹以及成虫不同组织中的表达量。结果表明,在幼虫期,CsupOBP1、CsupOBP3、 CsupOBP6、CsupOBP8、CsupOBP9、CsupOBP10、CsupOBP18以及CsupOBP24在头部的表达量均明显高于其他组织,其中CsupOBP1、 CsupOBP8、CsupOBP10、 CsupOBP24在头部特异表达；在成虫期,CsupPBP4、CsupOBP1、CsupOBP3、CsupOBP4、 CsupOBP8、CsupOBP10、CsupOBP11以及CsupOBP24在两性触角中特异性表达,CsupOBP20、CsupOBP30、CsupOBP33在两性触角中高表达；CsupOBP18在雌虫触角中特异性表达。这些基因可能在二化螟的嗅觉或味觉感受中起作用。3.二化螟CsupOBP8的原核表达及配体结合能力分析鉴于CsupOBP8基因只在幼虫期头部和成虫期雌雄触角中表达,推测其在二化螟的嗅觉及味觉中起作用,为此进一步进行了体外功能研究。首先将该基因编码成熟蛋白序列构建到pET-30a(+)表达载体中,在大肠杆菌Escherichia coli中经IPTG诱导进行大量表达,表达产物经镍离子亲和层析、肠激酶酶解等步骤,得到纯化的CsupOBP8蛋白。然后以1-NPN为探针,利用荧光竞争结合实验,测定了CsupOBP8对包括30种常见植物挥发物及3种性信息素组分在内的不同气味物质的结合能力。结果表明,CsupOBP8与β-紫罗兰酮、橙花叔醇、法尼醇、2-己酮等4种气味物质具有较强的结合能力,其Ki值分别为4.9、13.1、14.0、15.0μmol·L-1；此外,对苯甲醛、庚醇、2,6-二叔丁基苯酚、雪松醇、苯乙酮等5种物质也有一定的结合能力,其Ki值为22.3-30.8μmol·L-1。分析认为,CsupOBP8可能通过对这些气味物质的结合与运输,在二化螟幼虫和成虫对寄主植物的嗅觉中发挥作用。4.褐飞虱CSP基因的克隆及序列分析结合转录组数据分析并利用RACE技术,克隆了褐飞虱9个CSP基因的全长cDNA序列,分别命名为NlugCSP1-9。氨基酸序列分析表明,这9个CSP均含有4个保守性的半胱氨酸位点,为典型的CSP基因。不同NlugCSP序列之间的一致性变化较大,从10%到77%。进化树分析发现,9个基因中只有NlugCSP5、NlugCSP7和NlugCSP8聚在同一组,其余则分散于不同组中,暗示褐飞虱不同CSP存在功能分化。5.褐飞虱CSP基因的时间和组织表达动态利用qPCR技术,对褐飞虱9个NlugCSP基因在若虫不同龄期以及成虫不同组织的表达量进行了测定。结果表明,随褐飞虱发育期的不同,NlugCSP基因的表达量也有较大变化。NlugCSP9主要在5龄若虫表达,NlugCSPS主要在长翅型成虫中表达,NlugCSP8则在5龄若虫以及长翅型成虫中均有表达。对成虫期不同组织的表达量分析表明,NlugCSP1在雄虫腹部显著高表达；NlugCSP2、4、5、7在雌虫翅中高表达；NlugCSP3、6、8、9则在雄虫足部高表达。进一步分析看出,NlugCSP7在昆虫各组织中的表达量显著高于其它NlugCSPs,且在翅、足、触角等化学组织中均有较高的表达,推测NlugCSP7可能参与了褐飞虱的化感过程。此外,由于NlugCSP1在雄虫腹部特异性高表达,推测其可能参与雄性生殖相关的生理过程。