肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是我国常见的恶性肿瘤之一在全球肿瘤致死原因中高居第3位,每年导致大约25-100万人死亡。肝细胞癌的治疗手段主要以手术、放化疗及生物治疗为主,但目前各种治疗手段尚无法完全抑制肝细胞癌的生长和转移。中医根据肝细胞癌的症状和体征,多将其归为积聚、癥瘕等范畴,认为是多种致病因素协同作用的结果,与正气亏虚密切相关,防治原则主要涉及扶正培本、解毒散结及活血化瘀等几个方面,在减轻肝癌患者临床症状、提高生存质量、延长生存期、减轻肝癌放化疗的毒副作用等方面疗效确切,具有一定的优势。肝细胞癌早期缺乏典型症状,起病隐匿,往往被人们忽略,以致漏诊误诊,给病人带来不可挽回的损失。临床症状明显者,肝细胞癌往往已进入中、晚期,给治疗带来一定的困难。侵袭和转移是肝癌的基本特征,也是影响肝癌治疗效果的关键,使得针对肿瘤复发、转移后的治疗成为延长患者生存的关键因素。肝细胞癌的转移侵袭是一个多步骤、多环节的复杂过程,各个环节都涉及到一系列基因的调控和表达。其中,Wnt/β-catenin信号通路成员的基因突变和(或)异常表达奠定了肝癌细胞增殖、转移和侵袭的分子生物学基础。Wnt信号通路是一条在生物进化中极为保守的信号通路,在正常细胞中无激活,其异常表达与人类疾病有着密切关系。Wnt信号通路可分为经典Wnt通路和非经典Wnt通路。经典Wnnt通路即Wnt/β-catenin信号通路,此通路由Wnt蛋白、跨膜受体、胞质蛋白、核内转录因子、下游靶基因等组成。正常情况下,Wnt/β-catenin信号通路仅在器官发育、胚胎轴分化和细胞再生等过程中短暂发挥作用,而其异常持续性表达与多种恶性肿瘤发生发展有关。Wnt/β-catenin信号通路未激活时,细胞内新合成的c-catenin与细胞质中腺瘤性结肠息肉病蛋白、轴蛋白、GSK-3β形成的降解复合物相互作用,刺激β-catenin发生磷酸化,随后被降解,而使β-catenin在细胞质内保持在低水平。Wnt/β-catenin信号通路激活后,其编码的Wnt蛋白作为胞外的信号分子,与细胞膜上特异性受体Frizzled蛋白结合,在LRP5/6的协同作用下,激活细胞质内的Dsh蛋白,Dsh蛋白能够将GSK-3β磷酸化而导致其失活。GSK-3β在β-caten in磷酸化的过程中起到重要的作用,其可促进β-catenin磷酸化,加速其降解。β-catenin作为Wnt/β-catenin信号通路重要的信号分子,在参与细胞间黏附,调控细胞生长、分化和凋亡等过程中,起到重要的作用。当GSK-3β磷酸化而失活后,β-catenin避免被磷酸化,未被磷酸化的β-catenin无法迅速被降解,可引起β-catenin在细胞质内积聚。当其在细胞质中的积累达到一定的程度时,则向细胞核内转移。在细胞核中β-catenin与转录因子家族Tcf/Lefs结合,可激活CD44v6、VEGF、MMP-2、cyclinD1 和 c-myc等一系列原癌基因而导致细胞增殖、分化和成熟。鳖甲煎丸出自东汉医家张仲景的《金匮要略》,由23味中药组成,全方寒热并用,攻补兼施,具有活血化瘀、解毒散结、益气养血的功效,常用于治疗肝癌、肝硬化、肝脾肿大、子宫肌瘤等疾病。在临床治疗肝癌中,具有疗效确切、副作用小等特点,在治疗肝癌方面具有一定的优势。研究目的通过采用血清药理学研究方法,研究鳖甲煎丸对肝癌细胞HepG2 中 Wnt/ β-catenin信号通路的信号分子、靶基因及抑制因子表达水平的影响,明确鳖甲煎丸通过调控Wnt/β-catenin信号通路抑制肝细胞癌侵袭转移的作用靶点,进一步探讨鳖甲煎丸抗肝细胞癌转移侵袭的分子机制。研究方法及内容1.含药血清的制备：Wistar大鼠饲养于室温(21-25℃)、相对湿度50-60%、昼夜各半的环境中,普通饲料喂养,自由饮水,32只Wistar大鼠随机分为高剂量药物组(H组)、低剂量药物组(L组)、阴性对照组(NC组)、索拉菲尼阳性对照组(P组)。H、L组分别将成人(60kg)临床剂量的20、10倍的鳖甲煎丸用生理盐水溶解配制成混悬液,按10 ml/kg灌胃给药,NC组以等量生理盐水灌胃,P组以50mg/kg索拉菲尼水溶液灌胃。2次/d,连续饲养3 d,于第4天给药2h后3%异戊巴比妥腹腔注射麻醉,腹主动脉取血,静置1h后,4000r/min离心30 min分离血清,经56℃灭活30 min,0.22μm过滤除菌后,置于-20℃冻存。2.细胞培养：肝癌细胞HepG2用10%FBS(体积分数)的DMEM培养于37℃、5%CO2饱和湿度的孵箱内,细胞处于对数生长期时进行传代,2.5×106/ml的密度接种于6孔板中,分为药物血清组(H/L/NC)、索拉菲尼阳性对照组(P组)、不含药物血清的培养基作为空白对照组(BC组)。待细胞贴壁后吸去上清,分别依照分组加入含药物血清(10%)的培养液及DMEM进行细胞培养,48h后收集细胞进行实验。3.Western blotting及免疫荧光法检测肝癌细胞HepG2细胞质及细胞核中Wnt/β-catenin信号通路信号分子β-catenin蛋白表达水平。4.Westem blotting检测肝癌细胞HepG2中Wnt/β-cateni n信号通路信号分子GSK-3β、磷酸化GSK-3β及AKT.磷酸化AKT蛋白表达水平。5.荧光素酶检测法检测肝癌细胞HepG2中β-catenin/TCF4复合物的活性。6.免疫组织化学法检测肝癌细胞HepG2中Wnt/β-catenin下游靶基因CD44v6.VEGF的表达水平。7.Westem blotting检测肝癌细胞HepG2中Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因MMP-2的表达水平。8.RT-PCR检测肝癌细胞HepG2中Wnt/β-catenin信号通路抑制基因DKK-1、FrpHE mRNA的表达水平。以上实验数据用均数±标准差(x±s)表示,采用单因素方差分析进行统计分析,以P<0.05认为差异有统计学意义。结果1. Western blotting检测β-catenin的表达水平：β-catenin在细胞质中的表达水平：与BC组和NC组相比,H组、L组和P组的β-catenin表达水平显著降低(P<0.05),BC组和NC组之间无显著性差异(P>0.05)；β-catenin在细胞核中的表达水平：与BC组和NC组相比,H组和P组的β-catenin表达水平显著降低(P<0.05),L组、BC组和NC组之间无显著性差异(P>0.05),表明鳖甲煎丸可抑制β-catenin在细胞质、细胞核中的表达,其抑制作用与药物浓度有关。免疫荧光检测其表达水平进一步表明该结果。2. Western blotting检测GSK-3β、磷酸化GSK-3 β的表达水平：与BC组和NC组相比,H组和P组的磷酸化GSK-3 β的表达水平显著降低(P<0.05),L组、BC组和NC组之间无显著性差异(P>0.05),各组之间GSK-3β表达水平无显著差异(P>0.05)。表明鳖甲煎丸对肝癌细胞HepG2中GSK-3β的表达无明显影响,但能显著降低磷酸化GSK-3β的表达水平。3.Western blotting检测AKT、磷酸化AKT的表达水平：与BC组和NC组相比,H组和P组的磷酸化AKT的表达水平显著降低(P<0.05),L组、BC组和NC组之间无显著性差异(P>0.05),各组之间AKT表达水平无显著差异(P>0.05)。表明鳖甲煎丸对肝癌细胞H epG2中AKT的表达水平无明显影响,但能显著降低磷酸化AKT的表达水平。4.荧光素酶检测法检测β-catenin/TCF4复合物的活性：H组、L组、P组与NC组及BC组相比均有显著性差异(P<0.05),表明鳖甲煎丸可抑制β-catenin/TCF4复合物的活性。H组与P组之间无显著性差异,但索拉菲尼对β-catenin/TCF4复合物活性的抑制作用强于鳖甲煎丸。5.细胞免疫组化法检测CD44v6、VEGF的表达水平：CD44v6及VEGF在H组、P组的表达水平与NC组、BC组相比均有显著性差异(P<0.05),L组与BC组相比无显著性差异(P>0.05),表明鳖甲煎丸能减少肝癌细胞HepG2中CD44v6、VEGF的表达,其抑制作用与药物血清浓度有关。6. Western blotting检测MMP-2的表达水平：与NC组及BC组相比,H组、L组、P组MMP-2蛋白的表达水平显著降低(P<0.05),表明鳖甲煎丸可显著降低肝癌细胞HepG2内MMP-2的蛋白表达水平。7.RT-PCR检测DKK-1及FrpHE mRNA表达水平：DKK-1 mRNA的表达H组>L组>NC组,且H组、L组与NC组和BC组之间比较有显著性差异(P<0.05),说明鳖甲煎丸能促进肝癌细胞HepG2中抑癌基因DKK-1的表达,且这种促进作用和药物剂量有关。而FrpHE mRNA L组表达高于H组,H组与NC组之间无显著性差异。结论1.鳖甲煎丸可减少肝癌细胞HepG2细胞质及细胞核中β-catenin的表达,抑制β-catenin/TCF4复合物的形成及降低其活性,其机制可能与鳖甲煎丸能够下调磷酸化AKT的表达,从而抑制AKT的活化,进一步减少肝癌细胞HepG2中GSK-3β磷酸化,使GSK-3β降解减少,促进了β-catenin的磷酸化,从而加快了β-catenin降解有关。β-catenin在肝癌细胞HepG2内的表达水平降低,使β-catenin入核减少,进一步阻断Wnt/ β-catenin信号通路的信号传递。2.鳖甲煎丸可显著降低Wnt/β-catenin信号通路靶基因CD44v6、VEGF和 MMP-2的表达水平,从而抑制肝细胞癌的侵袭转移以及肝癌组织中新血管的生成。3.鳖甲煎丸能够促进Wnt/β-catenin信号通路抑制基因DKK-1的表达,进一步抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活,表明促进抑制基因DKK-1的表达可能是鳖甲煎丸抗肝细胞癌的作用靶点之一。综上所述,鳖甲煎丸可以抑制Wnt/β-catenin信号通路的活化,调控其相关信号分子的表达水平,并进一步影响其下游靶基因的表达,从而抑制了肝癌细胞的增殖、侵袭和转移,达到抗肝细胞癌的目的。