尽管对肾细胞癌发生发展机制有比较深入的了解，但在全世界范围内每年仍有新增肾癌患者约190，000个，其中大约91，000死于肾癌。我国各地区肾癌的发病率及死亡率差异较大，肾癌的发病率和死亡率均有上升趋势。肾细胞癌的治疗方法有限。肾细胞癌和其他恶性肿瘤相比是一种对化疗耐药的肿瘤，对一般的肿瘤化疗药物反应率很低。对肾癌患者进行化疗和激素治疗并未能明显改善生存质量。对局限性肾细胞癌根治性肾切除手术可以取得较好的治疗效果，但大约20～30％的患者在诊断明确时已发生转移，另有20～40％的患者在行局限性肾癌根治术后发生远处转移。一旦发生转移，患者的五年生存率很差，大约在20％。针对肾癌的生物学特性，单一的治疗模式已不适合转移性肾癌的治疗。为了进一步改善治疗效果近年来国内外临床治疗中开展了免疫治疗和传统化疗相结合的探索。干扰素-α和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）联合运用的免疫化疗即为其中的一种治疗方案。有研究显示干扰素-α和5-FU的联合能协同增效，提高了转移性肾癌患者的总缓解率和生存率，但其具体机制还不清楚。临床治疗中仍有部分患者对这一治疗方案反应不佳。干扰素-α（interferon，IFN-α）是Ⅰ型干扰素，参与治疗肿瘤的机制包括抑制细胞增殖、控制细胞凋亡、调节免疫的作用，刺激机体的免疫活性细胞增殖及增强杀伤性T细胞细胞毒（CTL）效应。但在治疗过程中干扰素显示出的多效性提示可能有其他机制参与其中。其对血管生成方面有部分研究但还未有明确结论。研究显示干扰素对血管生成有一定的影响，有抗血管生成的作用和抑制内皮细胞增殖的作用。这种抗血管生成作用是通过激活免疫细胞实现还是有其他机制参与尚未得知。有研究显示可能与VEGF有一定的联系，是否这种机制与5-FU一起参与抗肿瘤效应目前也还不清楚。5-FU广泛的应用于治疗临床中的各种恶性肿瘤。全身应用5-FU治疗转移性肾癌也有多年的历史，但其单药有效率仅为5％～20％。胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP），胸苷酸合成酶（thymidylate synthase，TS）是5-FU体内活化和作用的两个关键酶，与5-FU的化疗效果有密切联系。胸苷磷酸化酶可逆性地催化胸腺嘧啶核苷转变为2-脱氧核糖-1-磷酸和胸腺嘧啶，即通过催化胸苷和胸腺嘧啶的相互转化而稳定细胞内胸苷的水平。进入体内的5-FU需经过TP的作用被活化后才具有抗癌作用。此外TP又名血小板源性内皮细胞生长因子，具有血管生成活性，在促进肿瘤新生血管方面有重要作用。TP参于了新生血管的生成，尽管具体的机制还不清楚但这一活性和它的核苷酸代谢酶活性相互独立。胸苷酸合成酶是合成胸苷酸的限速酶，可催化dUMP转化为dTMP，dTMP是DNA合成和修复所必需胸苷酸的唯一来源。TS是合成胸苷酸的限速酶，催化dUMP转化为dTMP，而dTMP是DNA合成和修复所必须的胸腺嘧啶核苷酸的唯一来源，所以TS在细胞增生过程中发挥重要作用。TS也被证明是5-FU作用的靶酶，5-FU就是通过抑制TS活性阻断DNA合成而发挥抗肿瘤的作用。鉴于TP，TS和5-FU化疗效果有紧密联系，而VEGF和TP的血管生长活性可能受IFN-α调节。三个基因的表达变化可能会影响到IFN联合5-FU这种免疫化疗的效果。因此有必要深入了解干扰素调节TP，TS和VEGF表达变化情况，阐明干扰素联合5-FU化疗的协同机制。到目前为止，该领域开展的体内研究不多，还未见对以上三个基因在联合用药过程中对比分析。为此，本研究拟采用RT-PCR，免疫组化和MTT等方法观察人肾细胞癌中TP，TS的表达水平与临床病理因素和5-FU的敏感性之间的联系，然后利用RT-PCR，免疫组化，Western-blot，流式细胞仪和TUNEL检测体内和体外环境下干扰素-α对肾细胞癌中TP，TS和VEGF表达的调控作用，以及这种调控对肾细胞癌凋亡水平和5-FU化疗敏感性的影响，来评估TP，TS和VEGF表达变化在干扰素-α联合5-FU化疗协同作用中的地位，以期为临床肿瘤个体化治疗方案的制定提供参考指标。本研究共分以下3部分。第一部分肾细胞癌中TP，TS表达与临床病理特征及药敏关系的研究方法1．半定量RT-PCR的方法对43例肾细胞癌患者的肿瘤标本和7例正常肾组织标本进行TP和TS mRNA相对表达量检测。2．应用免疫组化技术对上述标本进行TP，TS和CD₃₄蛋白表达的检测。3．利用图文分析系统分析上述标本中以CD₃₄反映的微血管密度和TP蛋白表达的相关性。4．应用原代细胞培养技术分离培养26例肾细胞癌标本中的癌细胞，通过MTT法检测癌细胞对5-FU的敏感性，并与TP，TS mRNA和蛋白表达结果相结合，分析TP和TS表达与5-FU敏感性的相关联系。5．统计学处理应用SPSS 13.0统计软件包对所有资料进行统计学处理。采用了t检验、方差分析、相关性检验。以α=0.05为检验水准，P＜0.05认为差异有统计学意义。结果1．肾细胞癌组织和正常肾组织均有TP，TS mRNA表达且表达水平变化幅度较大。肾癌TP mRNA表达范围在0.31～0.88，平均0.7193±0.1282。TS mRNA表达范围在0.48～0.91，平均0.7400±0.0954。正常肾组织中，TP mRNA表达范围在0.24～0.43，平均0.3359±0.0714。TS mRNA表达范围在0.36～0.61，平均0.4917±0.0886。癌组织中TP，TS mRNA的表达量均明显高于正常肾组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。2．肾癌组织中TP mRNA表达与肿瘤体积，分期，淋巴结转移和远处转移均无关（P＞0.05）。TS mRNA表达与肿瘤体积，淋巴结转移和远处转移无关（P＞0.05），但与肿瘤的分期有关（P＜0.05）。3．TP和TS蛋白在43例肾细胞癌中均有表达。TP蛋白表达在细胞浆，高表达时表达在细胞核。TS蛋白仅表达在细胞浆。正常肾组织TP的阳性表达率在28.57％（2／7），TS的阳性表达率在57.14％（4／7）。正常组织中TP，TS均表达在肾小管上皮细胞胞浆。4．TP蛋白的表达与肿瘤体积，分期和淋巴结转移无关（P＞0.05），但和远处转移有关（P＜0.05）。TS蛋白的表达与肿瘤体积，分期，淋巴结转移和远处转移均无关（P＞0.05）。5．TP mRNA与TP蛋白表达无相关性（P＞0.05）。TS mRNA表达与TS蛋白表达组之间存在一定相关性（P＜0.05）。6．肾细胞癌中微血管密度与TP蛋白表达有相关性，伴随MVD级别的升高TP蛋白的表达也逐渐增强（P＜0.05）。7．TP mRNA的表达量与肿瘤细胞对5-FU的敏感性无相关性（r=0.142，P＞0.05）。TS mRNA的表达量与肿瘤细胞对5-FU的敏感性呈负相关（r=-0.545，P＜0.01）。TP蛋白表达与5-FU敏感性无关（P＞0.05）。TS蛋白表达与5-FU敏感性有关。TS蛋白的低表达组中对5-FU敏感的比例高于高表达组，差别有统计学意义（P＜0.05）。第二部分干扰素-α调节肾癌细胞TP，TS和VEGF表达对5-FU敏感性的影响方法1．半定量RT-PCR的方法检测0、1000、3000、6000、12000IU／ml的干扰素-α2b对体外培养的肾透明细胞癌株786-O TP mRNA表达水平的影响。2．半定量RT-PCR的方法检測干扰素-α2b作用0、12、24、36、48、60、72 h对786-0细胞TP mRNA表达水平的影响。3．半定量RT-PCR的方法检测0、1000、3000、6000、12000IU／ml干扰素-α2b作用72 h对786-0细胞TS mRNA表达水平的影响。4．半定量RT-PCR的方法检测0、1000、3000、6000、12000IU／ml干扰素-α2b作用72 h对786-0细胞VEGF mRNA表达水平的影响。5．Western-blot技术检测干扰素-α2b对786-0 TP，VEGF蛋白表达水平的影响。6．应用细胞免疫组化检测干扰素-α2b处理的786-0细胞TP，TS蛋白表达变化。7．应用流式细胞仪检测干扰素-α2b及干扰素-α2b联合5-FU用药对786-0细胞凋亡的影响。8．MTT法测定干扰素对5-FU在786-0细胞半数抑制浓度(IC₅₀)的影响。结果1．6000IU／ml的IFN-α2b作用60 h时对TP mRNA的表达增强作用最佳。IFN-α2b的浓度与TP的mRNA的表达量之间呈剂量依赖性，说明存在一定的剂量—效应关系（r=0.901，P＜0.05）。IFN-α2b的作用时间与TP的mRNA的表达量之间呈时间依赖性，说明存在一定的时间—效应关系（r=0.886，P＜0.01）。2．在12000IU／ml浓度范围内IFN-α2b对TS的mRNA表达没有影响（P＞0.05）。3．当12000IU／ml的IFN-α2b作用72 h时对VEGF mRNA的表达抑制作用最佳。IFN-α2b的浓度与VEGF的mRNA的表达量之间呈剂量依赖性，说明存在负的剂量—效应关系（r=-0.934，P＜0.05）。4．对照组，3000和6000IU／ml IFN-α2b处理组中TP蛋白表达依次增强，VEGF蛋白表达依次降低。6000IU／ml干扰素-α2b能增强TP蛋白的表达，下调VEGF蛋白的表达。5．TP在IFN-α2b处理组的786-0细胞中均有胞浆和胞核的阳性表达，对照组仅有胞浆的表达，处理组TP蛋白表达强度高于对照组。TS表达在对照组和处理组中的表达无明显差异，仅在细胞浆中表达。6．IFN-α2b本身对786-0细胞的凋亡无明显影响。IFN-α2b联合5-FU可明显提高786-0细胞对化疗药的敏感性，凋亡和坏死的细胞均显著增加。第三部分干扰素调节TP，TS和vEGF表达影响肾癌5-FU化疗效果的体内研究方法1．指数生长期的786-0细胞，以2×1O⁶／只剂量接种到BALB／C裸鼠右腋皮下，建立786-0肾透明细胞癌裸鼠皮下移植瘤模型。将15只荷瘤BALB／C裸鼠分对照组，5-FU组，IFN-α2b+5-FU组。对照组和5-FU组分别腹腔注射生理盐水和25mg／kg 5-FU。联合组给予3×10⁵ IU／d IFN-α2b联合25 mg／kg 5-FU．2．药物处理28天后处死荷瘤小鼠测量移植瘤重量，体积。3．RT-PCR检测各组移植瘤组织中TP，TS和VEGF mRNA表达水平。4．免疫组化检测各组移植瘤组织TP，TS和VEGF蛋白在组织的定位及表达。5．Western-blot检测各组TP和VEGF蛋白表达。6．TUNEL检测各组移植瘤组织中凋亡细胞。结果1．对照组、5-FU组和5-FU+INF-α2b治疗后，对照组，5-FU组和5-FU+INF-α2b组移植瘤重分别为1.1820±0.4874g、0.6900±0.1517g、0.2500±0.1490g。各组肿瘤体积分别为1.0648±0.5336 cm³、0.5424±0.1591 cm³、0.0940±0.0492cm³。5-FU组和5-FU+INF-α2b组的移植瘤重量和体积明显小于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。2．5-FU+INF-α2b组中移植瘤的TP mRNA表达量大于对照组和5-FU组（P＜0.05）。对照组和5-FU组中TP mRNA的表达量差异无统计意义（P＞0.05）。3．5-FU组中移植瘤TS mRNA表达量明显高于对照组和5-FU+INF-α2b组，5-FU+INF-α2b组的TS mRNA表达量最低，三组之间的差异均有统计学意义（P＜0.01）。4．三组中VEGF mRNA表达量差异无统计学意义（F=0.076，P＞0.05）。5．TP在15例组织中，均有表达。在对照组和5-FU组中弱阳性，在5-FU+INF-α2b组中强阳性，并出现TP的核表达。6．TS在12例组织中表达，对照组1例，5-FU+INF-α2b组2例呈阴性。TS在5—FU组中强阳性，在对照组和5-FU+INF-α2b组中弱阳性。7．VEGF在15例组织中，均有表达。在对照组、5-FU组和5-FU+INF-α2b组中均强阳性。8．TP蛋白印迹在5-FU+INF-α2b组表达增强同5-FU组和对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。9．对照组、5-FU组和5-FU+INF-α2b组VEGF蛋白印迹表达量差异无统计学意义（P＞0.05）。10．对照组中肿瘤细胞的凋亡指数为5±3，5-FU组和5-FU+INF-α2b组的凋亡指数分别为23±5和34±10。5-FU组和5-FU+INF-α2b组同对照组相比凋亡指数的差异有统计学意义（P＜0.01），但两组之间差异未发现有统计学意义（P＞0.05）。结论1．TP、TS mRNA在肾细胞癌组织中的表达水平与其相应的正常组织之间存在差异。肾细胞癌TP mRNA表达水平高于正常组织，TP蛋白表达和远处转移相关，TP蛋白表达和微血管密度正相关，这三方面显示TP参与了肾细胞癌的进展过程，对其生长有促进作用。2．TP mRNA水平不能反映蛋白表达水平，提示蛋白表达存在转录后翻译水平的调控。3．无论是mRNA水平检测还是蛋白水平，TS表达与肾细胞癌患者对5-FU的敏感性均相关。预示组织低表达TS的肾细胞癌患者适用5-氟尿嘧啶类药物的化疗。检测TS表达对预测以5-FU为基础的化疗疗效有指导作用。4．IFN-α2b在一定浓度内能通过剂量和时间效应方式增强786-0细胞TPmRNA和蛋白的表达，但786-0细胞的凋亡率并不减少。这说明IFN-α2b抑制了TP表达增高对凋亡的抵抗作用，并通过提高TP表达增加786-0对5-FU的敏感性。5．裸鼠进行5-FU化疗后，TS在移植瘤表达增强。IFN-α2b不能影响786-0细胞中TS mRNA表达，但能抑制裸鼠移植瘤内5-FU化疗伴随的TS蛋白表达增高，提示存在IFN-α2b间接干预TS表达的机制。这种间接干预增加肿瘤细胞对5-FU的敏感性。6．IFN-α2b在一定浓度内下调786-0细胞中VEGF mRNA和蛋白的表达，但在裸鼠体内这种作用消失，说明IFN-α2b对VEGF的调控受肿瘤微环境中其它一些因子的影响，VEGF在体内表达与IFN-α联合5-FU化疗效果的联系需要多方面研究。7．TP和VEGF受IFN-α2b调节时在786-0细胞中表达变化相异说明两者受不同的信号通路调控表达。