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目的本课题研究以芪丹通脉方为代表方的益气活血治法促进血管新生的作用,应用转基因斑马鱼血管损伤模型和人脐静脉内皮细胞模型,从促进血管新生角度出发,为临床运用芪丹通脉方治疗冠心病提供现代基础研究理论支持。方法1.运用内皮细胞生长因子受体激酪氨酸激酶抑制剂VRI诱导转基因斑马鱼(血管内皮细胞绿色荧光标记)鱼系Tg(Fli-1:EGFP)y1建立斑马鱼体内节间血管损伤模型,模型建立之后,加入芪丹通脉方总方(QDTM)和单味药水煎液进行药物治疗与干预,单味药分别为黄芪(HQ)、丹参(DS)、川芎(CX)、虎杖(HZ)、山楂(SZ)。实验设计分组分为空白对照组(以斑马鱼胚胎培养液作为空白对照组)、模型组(VRI诱导)、不同浓度给药组(VRI+QDTM、VRI+HQ、VRI+DS、VRI+CX、VRI+HZ、VRI+SZ),药物干预24h后,在荧光倒置显微镜下观察不同浓度的药物对于VRI损伤斑马鱼节间血管的恢复作用。2.运用斑马鱼(血管内皮细胞绿色荧光标记)鱼系Tg(Fli-1:EGFP)y1,发育良好受精24h的胚胎,显微镜下剥除胚胎外壳后,直接加入芪丹通脉方总方(QDTM)和单味药水煎液进行药物干预,单味药分别为黄芪(HQ)、丹参(DS)、川芎(CX)、虎杖(HZ)、山楂(SZ)。药物干预48h后,观察不同浓度的药物对斑马鱼肠下静脉血管生长的促进作用。3.运用人脐静脉内皮细胞HUVEC,通过细胞划痕建立细胞损伤模型,给与不同浓度的芪丹通脉方进行干预,观察不同浓度药物对内皮细胞迁移的促进作用。4.运用免疫印迹法检测促内皮细胞迁移相关蛋白的表达量。结果1.在荧光显微镜下观察芪丹通脉方和单味药黄芪(HQ)、丹参(DS)、川芎(CX)、虎杖(HZ)、山楂(SZ)水煎液对VRI诱导的斑马鱼节间血管损伤情况的修复情况,与对照组相比,VRI组斑马鱼节间血管显著减少,表明VRI诱导斑马鱼节间血管损伤模型建立成功。芪丹通脉方对VRI诱导斑马鱼节间损伤血管有明显的恢复作用(P<0.01),其中芪丹通脉方对斑马鱼损伤血管均有一定的修复作用,5mg/ml作用明显统计学差异(P<0.01)。单味药黄芪(HQ)、丹参(DS)、川芎(CX)、虎杖(HZ)、山楂(SZ)水煎液对VRI诱导的斑马鱼节间血管损伤情况的修复没有明显统计学差异。2.在荧光显微镜下观察芪丹通脉方和单味药黄芪(HQ)、丹参(DS)、川芎(CX)、虎杖(HZ)、山楂(SZ)水煎液对斑马鱼节间肠下血管生长情况的影响,与对照组相比,芪丹通脉方对肠下静脉血管均有出芽且交叉点增多,在5mg/ml浓度下作用明显(p<0.001)。黄芪(HQ)组对肠下静脉血管均有出芽且交叉点增多,在5mg/ml浓度下作用明显(p<0.05)。丹参(DS)组对肠下静脉血管均有出芽且交叉点增多,在5mg/ml浓度下作用明显(p<0.01)。川芎(CX)组对肠下静脉血管均有出芽且交叉点增多,在5mg/ml浓度下作用明显(p<0.001)。山楂(SZ)组对肠下静脉血管均有出芽且交叉点增多,在2mg/ml浓度下作用明显(p<0.05)。3.芪丹通脉方对HUVEC细胞迁移有促进作用。4.芪丹通脉方可增加促内皮细胞迁移相关蛋白的表达量。各组P38表达情况:与对照组相比,芪丹通脉方0.03mg/ml的浓度组,P38表达量无明显差异,在0.01mg/ml浓度和0.3mg/ml浓度的表达量与对照组相比有统计学差异(P<0.01)。各组AKT表达情况:与对照组相比,芪丹通脉方在浓度0.03mg/ml表达量无明显差异,在0.01mg/ml浓度和0.3mg/ml浓度的表达量与对照组相比有统计学差异(P<0.01)。结论1.以益气活血化瘀为理论基础,芪丹通脉方有促进血管新生的作用。2.芪丹通脉方对斑马鱼肠下静脉血管生长有促进作用,可以促进斑马鱼肠下静脉血管出芽,其中黄芪、丹参、川芎、山楂单味药也可以促进斑马鱼肠下静脉血管出芽和肠下静脉血管交叉点的增加。3.芪丹通脉方对VRI诱导的斑马鱼节间血管损伤有修复作用。4.芪丹通脉方促进血管新生和HUVEC细胞迁移可能与上调P38、Akt的表达量有关。