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睡莲是睡莲科(Nymphaeaceae)睡莲属(Nymphaea)多年生水生草本观赏植物,分为热带睡莲和耐寒睡莲两个生态类型。本研究以35个热带睡莲品种和119个耐寒睡莲品种的花瓣为材料,在花色表型分析基础上,利用高效液相色谱(HPLC-DAD)和液质联用技术(HPLC-ESI-MSn)对睡莲花瓣内的类黄酮成分进行了定性和定量分析。研究了两种生态类型睡莲品种间的色素组成差异,并探讨了睡莲花色形成的化学机制。研究结果如下:1、睡莲花色分布在色相a*和b*的二维空间上,耐寒睡莲花色分布由第二象限的黄色区域开始,跨越第一象限,大部分集中分布在第四象限靠近a*轴的粉色和红色区域,在第三象限则没有分布。热带睡莲拥有耐寒睡莲所缺乏的蓝色和蓝紫色花,其花色远比耐寒睡莲丰富,在一、二、三、四象限都有分布,从第二象限的黄色、白色品种开始,跨越分布在第一象限的复色品种,粉色、红色、蓝色和蓝紫色品种集中分布在第四象限。2、睡莲花瓣中的类黄酮色素通过筛选流动相体系,优化洗脱梯度、温度、流速等分析参数,建立了分析睡莲花瓣中类黄酮成分的HPLC方法。利用标准品和HPLC-ESI-MSn联用技术,在热带睡莲花瓣中鉴定或推定了 34种类黄酮成分,包括11种花青苷、22种黄酮醇苷和1种查耳酮苷。其中17种类黄酮化合物在热带睡莲花瓣中首次报道。它们分别是:4种花青苷:飞燕草素(Dp)的3-鼠李糖-5-半乳糖苷(Dp3Rh5Rh)、3-2"-没食子酰-6"-乙二酰鼠李糖苷(Dp3galloyl-oxalylRh)、3-6"-乙酰葡萄糖苷(Dp3acetylG);矢车菊素(Cy)的3-2"-没食子酰半乳糖-5-鼠李糖苷(Cy3galloylGa5Rh);12种黄酮醇苷:杨梅素(My)的7-鼠李糖-(1→2)-鼠李糖苷(My7RhRh)、3-半乳糖苷(My3Ga)、3-没食子酰鼠李糖苷(My3galloylRh);槲皮素(Qu)的7-半乳糖-(1→2)-鼠李糖苷(Qu7GaRh)、7-半乳糖苷(Qu7Ga)、3-乙酰半乳糖苷(Qu3acetylGa);山奈酚(Km)的7-半乳糖-(1→2)-鼠李糖苷(Km7GaRh)、7-没食子酰半乳糖-(1→2)-鼠李糖苷(Km7galloylGaRh)、3-半乳糖苷(Km3Ga)、3-3"-乙酰鼠李糖苷(Km3-3"acetylRh);异鼠李素(Is)的7-半乳糖苷(Is7Ga)、7-木糖苷(Is7Xy);1种查耳酮糖苷:柚苷苷元查耳酮的2’半乳糖苷(Chalcone 2’Ga)。在119个耐寒睡莲品种的花瓣中检测出14种花青苷、5种黄酮苷、46种黄酮醇苷、2种黄烷酮糖苷和8种查耳酮糖苷,共75种类黄酮成分。除6个花青苷:飞燕草素(Dp)的3-半乳糖苷(3Ga)、3-2"-没食子酰-半乳糖苷(3galloylGa)、3-6"-乙酰-半乳糖苷(3acetylGa)、3-2"-没食子酰-6"-乙酰-半乳糖苷(3galloyl-acetylGa);矢车菊素(Cy)的3-6"-乙酰-半乳糖苷(3acetylGa)、3-2"-没食子酰-6"-乙酰-半乳糖苷(3galloyl-acetylGa)和5种黄酮醇糖苷:杨梅素(My)的3-半乳糖苷(3Ga)、3-鼠李糖-(1→6)-半乳糖苷(3Rh(1→6)Ga)、3-鼠李糖苷(3Rh);槲皮素(Qu)的3-鼠李糖苷(3Rh)和山奈酚(Km)的3-鼠李糖苷(Km3Rh)为已知组分外,其余64个组分是首次在耐寒睡莲中报道。3、热带睡莲与耐寒睡莲花瓣中类黄酮的组成和含量比较首先从花青苷组成上看,两种生态类型的睡莲含有的花青苷元是一致的,都含有Dp和Cy型色素,并且参与糖苷化的糖的类型和参与酰基化的有机酸的类型都相似。在热带睡莲花瓣中共检出11种花青苷,包括7种Dp衍生物、3种Cy衍生物和1种未知的组分;而在耐寒睡莲花瓣中共检出14种花青苷,包括8种Dp衍生物和6种Cy衍生物。从总花青苷(TA)含量来看,耐寒睡莲花瓣中TA含量最高为5.22mg/gFW,其余品种TA含量在0.88 mg/g FW左右;而在热带睡莲中颜色很深的红色花品种花瓣中TA含量最高,也仅为1.43mg/gFW,其余品种TA含量仅0.39mg/gFW左右;热带睡莲的TA值明显比耐寒睡莲花瓣中要低得多。其次,从其它类黄酮组成(包括黄酮、黄酮醇、黄烷酮和查耳酮)上看,从热带睡莲花瓣中检测到22种黄酮醇苷和1种查耳酮糖苷;而在耐寒睡莲花瓣中共检测出5种黄酮苷、46种黄酮醇苷、2种黄烷酮糖苷和8种查耳酮糖苷。而且在耐寒睡莲中除检测到常见的My、Km、Qu、Is型黄酮醇苷和查耳酮糖苷外,还发现了 Pa型黄酮醇苷、Lu、Ch型黄酮苷和Nar型黄烷酮苷,数量和种类都比热带睡莲多。从总类黄酮(花青苷除外)(TF)含量上看,耐寒睡莲中TF含量最高为16.78 mg/g FW,而热带睡莲中最高仅为7.93mg/gFW,还不到耐寒睡莲的一半。耐寒睡莲与热带睡莲花色差异,最主要的原因是其类黄酮组成和含量的差异。4、睡莲花色与类黄酮组成之间的关系影响热带睡莲花色的因素较多。其中Dp3galloylGa、Dp3’galloyl-acetylGa、Dp3galloyl-acetylGa、Cy3galloyl-acetylGa 和 Km3-2"acetylGaRh 与色相 a 呈正相关;而 Dp3galloylGa 和 Dp3’galloyl-acetylGa 与色相 b 呈负相关。Qu3Rh 和 Qu3’Xy 与明度L*正相关,而Dp3’galloylGa与明度L*呈负相关。Chalcone2’Ga与色相a*呈负相关而与色相b*和明度L*呈正相关关系。要想使得花色的红色调增加并且花瓣色彩更加鲜艳,就必须增加 Dp3galloylGa、Dp3’galloyl-acetylGa、Dp3galloyl-acetylGa、Cy3galloyl-acetylGa 和 Km3-2"acetylGaRh 的含量,而增加 Chalcone2’Ga 的含量,花色将变得更加鲜黄,同时明度将有一定程度的增加。耐寒睡莲的花色与色素组分之间存在显著的相关性。Dp3galloylGa和Cy3acetylGa与明度L*值呈负相关,而Km3Ga和Qu7Ga与明度L*值呈正相关。Qu3Rh、Qu7Ga、Qu7A 和 THC2’digalloylG 与色相 b*值呈正相关,而 Cy3acetylGa、Pa3Xy 和 Chalcone2’Ga的含量与色相b*值呈负相关。回归方程显示影响a*值的因素很多:其中Dp3galloylGa、Cy3Ga(1→2)Ga和Cy3acetylGa的含量与色相a*值正相关性较大,而Qu7Ga和THC2’digalloylG的含量与色相a*值负相关性较大。因此,增加Dp3galloylGa、Cy3Ga(1→2)Ga和Cy3acetylGa的含量可有效提高花瓣的红色程度,并在一定程度上降低花瓣明度和黄色程度,而THC2’digalloylG的有效积累可使花瓣的红色减褪而形成更鲜艳的黄色。5、推定睡莲花瓣类黄酮代谢途径根据睡莲花瓣中检测到的类黄酮终产物,推定了目前最完整的睡莲花瓣类黄酮代谢途径。即从香豆酰-CoA和丙二酰-CoA生成4,2’,4’,6’-四羟基查耳酮开始,一方面可以通过糖苷化生成Chalcone2’Ga,另一方面在CHI酶作用下发生异构反应生成柚皮素。而后以柚皮素为中心,在一系列酶催化下,产生了 9种类黄酮苷元,进而生成各种糖苷终产物。