MSTN(Myostatin肌肉生长抑制素),是骨骼肌生长发育的负调控因子,敲除该基因使其缺失后,肌肉量增加。DGAT1是甘油酰基转移酶(Diacylgycerol Acyltransferase, DGAT)的一种,它与脂肪的合成与分解代谢、脂类在组织中的沉积密切相关。CRISPR/Cas9基因编辑系统,通过gRNA的介导,识别DNA的特定位点,从而引导Cas9蛋白进行特异性地切割,DNA断裂后会启动两种修复机制,从而实现基因的敲除或敲入。本实验利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,获得了敲减MSTN的同时定点敲入DGAT1的阳性细胞,希望为生产产肉量多肉质鲜美的转基因大动物提供依据。实验结果如下：1成功构建了CRISPR/Cas9系统中关键载体gRNA及打靶载体CAG-DGAT1本实验成功构建了CRISPR/Cas9系统中针对小鼠MSTN基因的gRNA,通过Surveyor突变检测试剂盒进行了检测,实验结果证明在该gRNA的引导下Cas9可以高效的对DAN进行切割。本实验还构建了打靶载体CAG-DGAT1,采用PCR、酶切和测序的方式进行鉴定,证明载体准确无误。2小鼠成纤维细胞与小鼠胚胎干细胞转染方式的选择优化本实验采取了电转染和脂质体转染两种方式对两种不同的细胞进行转染比较,实验结果发现,对于小鼠成纤维细胞电转染的效率明显高于脂质体转染。而小鼠胚胎干细胞用脂质体转染的效果明显好于电转。3对转DGAT1基因细胞的检测通过跨同源臂检测的方法证明DGAT1基因已定点整合到细胞的MSTN位点。为了验证基因插入后的效果,通过实时定量PCR分别检测了目的基因及脂肪代谢相关基因和与肌肉发育相关基因的表达情况。结果表明,转阳性细胞中DGAT1的表达量是对照组的32.76倍。随着DGAT1含量的提高,脂肪代谢有关基因的表达有不同程度的上调,乙酰辅酶A羧化酶上调1.58倍,脂肪酸结合蛋白4上调7.11倍,DGAT2上调2.93倍。说明DGAT1的上调对促进了脂肪的合成。解偶联蛋白1表达量也提高了2.17倍。因为在小鼠MSTN基因上定点插入DGAT1,所以本实验还检测了肌肉相关基因的表达情况,结果显示Foxol相比对照上调23.53倍。Mef2c是对照的0.66倍,表达量下调。