论文部分内容阅读
特发性肺纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)近年来已成为呼吸系统疾病研究的热点。IPF属于弥漫性肺部炎性疾病,病变主要累及肺间质,其病理特征是肺泡上皮损伤、成纤维细胞灶的形成以及细胞外基质的过度沉积,最终导致了肺组织异常重塑。关于IPF的发病机制目前还没有完全明确,亦缺乏特异有效的治疗药物与方法。传统的免疫抑制剂对IPF有一定的疗效,可说明免疫微环境对肺纤维化的形成与发展有一定的影响。对近年来文献报道的治疗肺纤维化的有效方剂进行数据挖掘,结果显示,益气活血法是众多医家的共识。药物关联分析结果表明,黄芪当归对药(即当归补血汤的组成)的支持度和信度最高。临床经常使用比例为5：1,即当归补血汤,但古代文献亦有5：6、2：1、4：1、10：3等记载。但黄芪和当归联合应用对IPF小鼠肺组织修复的作用和局部免疫微环境的影响以及两者配伍的最佳比例尚无资料报道。故制定了大小剂量黄芪当归5：1组、1：1组、1：5组。将不同配比与剂量的黄芪当归对药作用于用博莱霉素诱导的雄性ICR小鼠肺纤维化模型,以小鼠的死亡率为药效指标,来寻找黄芪当归对药的最优配伍比例与剂量。本实验的目标在于阐明黄芪当归对药对肺组织局部免疫平衡的干预作用及对肺组织修复的分子机制,以望寻找到黄芪当归治疗IPF的最佳的配伍模式。这不仅对临床用药有一定的指导作用,而且为肺纤维化的发病机制及治疗提供新的思路。理论研究以“肺痿”、“肺痹”、“肺纤维化”为主题词,检索中国科技期刊全文数据库(CNKI)2000年-2014年的文献。筛选出主治或功用明确是“肺瘘”、“肺痹”、“肺纤维化”的各种临床研究、实验研究的方剂共92篇。实验研究50篇,临床研究42篇,涉及中药132味,用药频次共计为862次。用药频次在10次以上者有24味。聚类分析结果分为益气药、活血药、养阴药、化痰药、清热止咳药五类。关联规则分析结果得到药对关联规则13条,药对11对。黄芪当归药对支持度最高,这为后期实验研究提供了理论依据。实验研究1不同配比与剂量的黄芪当归对药对IPF小鼠生存状况的影响ICR小鼠80只,雄性,SPF级,体重18-22g,随机分为正常对照组、模型组、以及6个不同配比与剂量的黄芪当归组成的中药治疗组,每组10只。除正常对照组外,其余各组采用气管内注射博莱霉素(5mg/kg)复制小鼠肺纤维化模型。造模第二天起,正常对照组和模型组用生理盐水灌胃,6个中药治疗组给予不同配比与剂量的黄芪当归水煎液灌胃治疗。观察各组小鼠的生存状态并统计死亡情况。结果显示,各中药治疗组小鼠的生存状态因黄芪当归的剂量与比例不同而有所差异。中药第1、5、6组7天炎症期死亡率较低,其中1、6组的低死亡率一直持续到第28天。2不同配比与剂量的黄芪当归对药对IPF小鼠肺形态学的影响小鼠造模方法同实验一,在给药后第28天,用腹主动脉放血的方法处死小鼠,并迅速开胸,切下右下肺叶放在4%的多聚甲醛溶液中固定72小时,然后经过脱水、浸蜡、包埋等步骤后制成石蜡切片,用于HE染色及武兆发简化Mallory氏胶原染色,观察肺组织形态变化与胶原含量变化。HE染色和Mallory氏胶原染色显示,模型组小鼠肺泡组织结构基本消失,支气管周围和肺泡间隔可见大量炎性细胞浸润,并有充血渗出,呈明显纤维化改变。6个中药治疗组较模型组均有所改善,其中中药治疗第1、6组改善明显,肺泡结构已基本恢复。3不同配比与剂量的黄芪当归对药对IPF小鼠肺组织HYP含量的影响IPF小鼠肺组织中存在着大量的胶原纤维,构成胶原纤维的主要成分是胶原蛋白,羟脯氨酸在胶原蛋白中含量最多,利用这一特点,对肺组织中羟脯氨酸含量的测定,可掌握肺内胶原纤维分解代谢情况。本实验研究结果显示,模型组小鼠肺组织HYP含量较正常对照组明显升高(P<0.01),说明模型组小鼠肺组织胶原含量明显增加,胶原代谢出现异常。与模型组比较,各中药组均可降低肺内HYP含量,其中第1、6组小鼠肺组织HYP含量降低显著。4不同配比与剂量的黄芪当归对药对IPF小鼠TGF-β、IL-6、Foxp3、RORγt基因表达水平的影响通过对大小剂量不同配比的黄芪当归对药对IPF模型小鼠肺组织内TGF-β、IL-6、 Foxp3、RORγtmRNA含量的比较可以看出,中药组对调节Th17/Treg细胞因子有一定作用。模型组TGF-β、IL-6、 Foxp3、RORγtmRNA的表达高于正常对照组。大、小剂量黄芪当归5：1组对恢复小鼠肺组织中Foxp3的表达作用较强,以恢复Th17/Treg的失衡。大、小剂量黄芪当归1：5组对降低TGF-β的表达效果显著,提示当归用量越大对TGF-β的抑制作用越明显。大、小剂量黄芪当归1：1组对降低RORγt、IL-6的表达作用明显。综合前面的实验结果,大剂量黄芪当归5：1组各基因表达水平与正常组接近,对减轻肺纤维化作用显著,其机制可能与抑制Thl7分化关键基因TGF-β、IL-6、RORγtmRNA的表达,恢复Treg分化关键基因Foxp3 mRNA的表达有关。5不同配比与剂量的黄芪当归对药对IPF小鼠组织修复相关基因表达水平的影响当肺组织损伤后,会使肺泡毛细血管屏障受损,从而造成肺组织内出血,血小板被激活,释放多种细胞因子,这些细胞因子可激内皮细胞、肌成纤维细胞和上皮细胞。异常激活的肺泡上皮细胞产生的介质,可诱导成纤维细胞灶的形成,造成疤痕和肺结构的破坏。FGF2能促进新生血管形成,可趋化并募集间充质细胞、成纤维细胞等到创伤部位,从而启动创伤愈合的进程。VEGF是作用于血管内皮细胞的生长因子,具有促进血管内皮细胞分裂、增殖、促进血管形成、增加血管的通透性、维持血管完整性的作用。血管的生成是修复损伤的组织的必要条件,也是肺纤维化的重要病理变化。前期研究发现,支气管肺泡干细胞(BASCs)在博来霉素导致的小鼠肺纤维化模型中数量显著下降,提示BASCs的数量和功能可能与肺纤维化的发生与进展相关。SCF/c-kit信号恰恰是BASCs存活的必要条件。本实验通过检测中药组对IPF模型小鼠肺组织内VEGF.FGF2、 c-kit、Cx43、mouse collagen1、mouse collagen3mRNA含量的影响,探求其作用机制。与对照组比较,模型组肺组织c-kit、FGF2、VEGF、Cx43、mouse collagen1、mouse collagen3的mRNA转录水平均升高(P<0.05或P<0.01)。中药各组c-kit、Cx43、mouse collagen1、mouse collagen3mRNA的表达水平较正常对照组均降低,其中中药第1组的相对表达量与正常组最接近。FGF2mRNA的表达,中药第1、5组高于正常对照组,其余组较对照组降低。VEGFmRNA的表达,中药第1、3组高于正常对照组,其余组较对照组降低,但均无统计学差异。与模型组比较,中药各组c-kit、FGF2、VEGF、Cx43、 mouse collagen1、mouse collagen3mRNA的表达水平均降低。综合上述结果,大剂量黄芪当归5：1组各基因的表达水平与正常对照组更接近,分析其可能通过抑制c-kit.FGF2、 VEGF、Cx43、mouse collagen1、mouse collagen3mRNA的表达,调节损伤的肺脏局部的血管生成与组织的异常修复,从而起到抗纤维化的作用。6不同配比与剂量的黄芪当归对药对IPF小鼠Th17/Treg细胞的影响在对IPF的研究中已经证实了Th17/Treg细胞比例失衡的存在。以往研究发现IPF的发病进程中CD4+IL-17A+Th17细胞介导的反应占主导优势,而CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比降低,抑制炎症反应能力低下,无力抗衡Th17细胞,使Th17/Treg处于失衡状态。本研究发现在肺纤维化小鼠模型体内CD4+IL-17A+Th17细胞百分比与正常组比较无明显差异,而CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比则略升高,与相关文献研究结果不同。除中药第3组外,其余各中药治疗组CD4+IL-17A+Th17细胞百分比均高于模型组,但无统计学差异。各中药治疗组CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比均低于模型组,差异亦无统计学意义。Th17细胞与Treg细胞的比例,除中药第3组低于模型组外,其余中药治疗组二者比值均高于模型组,但无统计学差异。CD4+IL-17A+Th17细胞介导的反应占主导优势是否会加速IPF的病程发展仍需进一步研究。在本实验中,小剂量黄芪当归1：5组小鼠存活率最高,其CD4+IL-17A+Th17细胞数量较模型组升高,而CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞百分比则降低,这可能是其抗肺纤维化并改善小鼠生存状况的机制之一,其具体机制仍有待进一步深入探究。