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食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)在我国是高发癌种，预后差。肿瘤浸润转移是食管鳞癌的主要死因。从分子水平上了解食管鳞癌的发展机制，将有助于提高这些患者的预后。现有的资料表明食管癌的发展和浸润转移是多基因协同作用的结果，主要相关基因包括NF-kB、COX-2、VEGF、VEGF-C和VEGFR-3等。靶向药物治疗是食管癌治疗的曙光。现资料表明，ESCC的浸润转移与上述基因引起的微血管和淋巴管的新生关系密切。抑制微血管淋巴管的新生是治疗ESCC的有效手段。虽然现针对上述基因有相应的靶向药物，但在临床研究中，这些药物对食管鳞癌的治疗效果并不理想，因此有效的治疗靶点并未明确。Notch信号通路是上述基因的上游通路，是多条血管生成调节通路的交汇点，对血管的生成有重要的调节作用。在多种肿瘤的体外试验中证实调控该基因可以抑制肿瘤的生长。该通路在不同的类型的肿瘤中表达不同，黑色素瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌和神经母细胞瘤等肿瘤中过表达，表现为致癌基因，但在上皮鳞状细胞癌中低表达，被认为是抑癌基因。本课题旨在研究Notch信号通路及其下游基因与食管鳞癌分化、浸润和淋巴结转移的关系，探讨Notch信号通路在食管鳞癌发展及微血管和淋巴管新生中的调控作用和作为靶向治疗靶点的可能性。
1.研究目的：
食管鳞癌的浸润转移与肿瘤诱导微血管和淋巴管新生密切相关，该过程是多基因协同作用的结果，相关基因包括NF-kB、COX-2、VEGF-A、VEGFR-1、VEGF-C和VEGFR-3等。靶向药物治疗是食管癌治疗的曙光，但有效的治疗靶点未明确。Notch信号通路是上述基因的上游通路。在其他肿瘤的体外试验中证实调控该基因可以抑制肿瘤的生长。本实验通过检测食管鳞癌组织和食管正常组织中的Notch1、NF-kB、COX-2、VEGF-A、CD34、VEGF-C和VEGFR-3的表达，探讨Notch1的异常表达与其下游信号通路表达异常之间的相关性。了解Notch信号通路及其下游基因与食管鳞癌、浸润、淋巴结转移、病理血管和淋巴管生成的关系以及相应的信号传导环节；为进～步探讨食管癌分了靶向治疗作用位点提供理论依据。通过对比分析患者的病理学指标与上述基因的关系，为食管癌病情的预测提供分子生物学依据。
2.研究方法：
2.1病例选择
以2007年5月至12月我院行食管癌根治术(全食管切除+胃食管主动脉弓上吻合+淋巴结系统采样)的病人为研究对象。所有病人术前均经检查证实无远处转移(M0)，术前未经化疗、放疗或靶向药物治疗。连续取48例切除的食管组织石蜡标本切片，其中异常组织40份，正常组织8份。全组病例均经术前食管镜取病理证实为鳞癌，术后病理(HE染色)证实为鳞癌组织和正常组织。其中男39例，女9例，平均58.21±10.66岁(36～79岁)。
2.2实验步骤
2.2.1标本采集
2.2.1.1手术切除的新鲜食管鳞癌病理标本及正常食管组织，采集后立即浸入10％福尔马林液保存。24小时内制成石蜡块标本。
2.2.1.2石蜡块标本切片，HE染色，显微镜下证实为鳞癌组织和正常组织。
2.2.2分组
按病理，标本分为2组：ESCC组和正常对照组；
按肿瘤分化程度，将ESCC组标本分为3组：高分化组、中分化组、低分化组；
按肿瘤淋巴结转移情况，将ESCC组标本分为2组：淋巴结(+)、淋巴结(-)；
按肿瘤T分期，将ESCC组标本分为2组：T3～4、T2。
2.2.3 Notch1、NF-kB、COX-2、VEGF、MVD、VEGF-C、VEGFR-3的免疫组化检测
2.3观察指标
2，3.1肿瘤分化程度：高分化、中分化、低分化
2.3.2肿瘤淋巴结转移情况：淋巴结(+)、淋巴结(-)
2.3.3肿瘤T分期：浸润全层(T3～4)、浸润肌层(T2)
2.4结果评估
2.5统计学分析
方差分析：采用SPSS13.0软件进行One-Way Anova进行分析，若方差不齐，则采用Krustal-Wallis检验。检验水平α=0.05
相关性分析：采用SPSS13.0软件进行Correlations进行分析，检验水平α=0.05
3.结果：
3.1 Notch1、NF-kB、COX-2、VEGF、VEGF-C、CD34(MVD)和VEGFR-3(LVD)在组织中的分布特点
3.2 ESCC组与对照组Notchl表达阳性率的组间差异有统计学意义(p=0.048)，NF-kB、COX-2、VEGF、VEGF-C表达阳性率的组间差异显著(p=0.000)。
3.3不同分化程度的ESCC中，Notch1表达阳性率随分化程度的降低而降低(70.0％>50.0％>31.3％)，各组值之间差异有统计学意义(p=0.000)。NF-kB、COX-2、VEGF、VEGF-C表达阳性率随分化程度的降低而升高(NF-kB:40.0％<64.3％<87.5％； COX-2:30.0％<57.1％<87.5％；VEGF:30.0％<50.0％<93.8％；VEGF-C:50.0％<64.3％<81.3％)，各组表达阳性率之间的差异有统计学意义(p=0.000)。
3.4 Notchl在LN(+)组的肿瘤组织中表达阳性率为37.5％，低于LN(-)组的表达阳性率54.2.0％，两者之间无统计学差异(p=0.069)。NF-kB、COX-2、VEGF、VEGF-C在LN(+)的肿瘤组织中的表达阳性率均高于LN(-)组的表达阳性率(NF-kB:100.0％>45.8％(p=0.039)；COX-2:93.8％>41.7％(p=0.036)；VEGF:93.8％>41.7％p=0.036)；VEGF-C:100.0％>45.8％(p=0.039))，两组的表达阳性率间比较有统计学差异(p<0.05)。
3.5 Notch1在T3～4分期组的肿瘤组织中表达阳性率为39.3％，低于T2组的表达阳性率66.7％，但两者之间无统计学差异(p=0.059)。NF-kB、COX-2、VEGF、VEGF-C在T3～4分期组的肿瘤组织中表达阳性率均高于T2组的表达阳性率(NF-kB:82.1％>33.3％(p=0.027)；COX-2:75.0％>33.3％(p=0.031)；VEGF:78.6％>25.0％(p=0.023)；VEGF-C:82.1％>33.3％(p=0.027))，两组的阳性率间比较有统计学差异(p<0.05)。
3.6 Notch1、NF-kB、COX-2、VEGF、MVD、VEGF-C、VEGFR-3作相关性分析
4.结论:
1.肿瘤内新生的微血管和淋巴管促进了食管鳞癌的浸润转移；
2.NF-KB-COX-2-VEGF/VEGF-C信号通路可能是通过促进肿瘤内微血管和淋巴管新生而促进食管鳞癌的浸润转移；
3.Notch1与VEGF、MVD、VEGF-C和VEGFR-3有负相关关系，因此在食管鳞癌可能表现为抑癌基因；
4.Notch信号通路与食管鳞癌微血管和淋巴管新生密切相关，可能可以通过调节该通路来调节肿瘤血管淋巴管的生成。该信号通路可能可以作为食管鳞癌血管靶向治疗的新靶点；
5.食管鳞癌的微血管淋巴管新生受是多条共同以VEGF和VEGF-C为靶基因的信号通路的共同调控，食管鳞癌的靶向治疗可能需要两种不同的靶向药物共同作用。
综上所述，在食管鳞癌组织中，肿瘤内新生的微血管和淋巴管促进了肿瘤的浸润转移。NF-kB-COX-2-VEGF/VEGF-C信号通路可能是通过促进肿瘤内微血管和淋巴管新生而促进食管鳞癌的浸润转移。Notch1的表达异常减少与下游基因VEGF、VEGF-C的异常增高有负相关关系，而且随肿瘤分化程度下降而表达减少，因此Notch1在食管鳞癌表现为抑癌基因。该通Notch信号通路与食管鳞癌微血管和淋巴管新生密切相关，可能可以通过调节该通路来调节肿瘤血管淋巴管的生成。该信号通路可能可以作为食管鳞癌血管靶向治疗的新靶点。此外，食管鳞癌的微血管淋巴管新生可能受是多条共同以VEGF和VEGF-C为靶基因的信号通路的共同调控，食管鳞癌的靶向治疗可能需要两种不同的靶向药物共同作用。