目的针对金钱草混伪品众多,临床使用混乱的现状,采用药材的性状、粉末显微、薄层色谱、HPLC指纹图谱、UV测定总黄酮含量、分子鉴定等分析方法,对金钱草及其常见混伪品药材浙金钱草、积雪草、连钱草、马蹄金、广金钱草进行鉴别研究,明确其主要的鉴别特征,建立专属性强、适用广和准确度高的金钱草正伪品鉴别的方法。方法1.通过眼看、手摸等方法分别对金钱草及其混伪品药材进行性状鉴定,比较其在形状、大小、颜色、气味等方面的异同。2.采用粉末显微观察比较金钱草及其混伪品药材在内含物类型、结构、颜色等方面的异同。3.以槲皮素、山柰素为对照品,采用薄层色谱法对金钱草及其混伪品药材进行鉴别,根据斑点比较其在槲皮素、山柰素位置的差异。4.采用高效液相指纹图谱法对金钱草及其混伪品药材进行研究,对其指纹图谱进行相似度比较和聚类分析,以此来区分正伪品。同样对不同产地的金钱草样品进行相似度比较和聚类分析,明确其道地性。5.以芦丁为指标,采用紫外分光光度法对金钱草及其混伪品药材进行总黄酮的含量测定,以此来考察其在总黄酮含量上的差异,并对金钱草乙醇提取物的体外抗氧化活性进行初步评价。6.提取金钱草及混伪品的基因组,通过PCR对其进行ITS2和rbcL序列扩增和测序,计算其碱基组成、长度情况,并对信息位点、变异位点等进行分析,基于K2P模型计算金钱草及混伪品的种内种间遗传距离,构建NJ树对其进行聚类分析,以此来区分正伪品。结果1.在性状上,金钱草及其混伪品药材的区别主要表现在茎、叶等方面,金钱草的叶对生,呈心形或宽卵形,全缘,主脉明显突起,用水浸后,对光透视可见黑褐色条纹。2.在粉末显微上,金钱草及其混伪品药材的区别主要表现在腺鳞、非腺毛等方面,金钱草内含红棕色腺鳞,薄壁细胞内含有红棕色物质,偶见非腺毛,混伪品的非腺毛、石细胞、方晶、色素块较多。3.在薄层色谱上,金钱草及其混伪品药材的区别主要表现在:金钱草出现了两个与对照品相同位置、相同颜色的黄绿色荧光斑点,混伪品药材除了浙金钱草并未同时出现两个位置、颜色均相同的斑点,。4.优化了金钱草HPLC的色谱参数,建立了 77批不同来源产地金钱草及其混伪品药材的HPLC指纹图谱共有模式,确定了 8个共有峰,指认出4号峰为芦丁,7号峰为槲皮素。金钱草与其混伪品药材的相似度不高,59批金钱草混伪品相似度均低于0.60,其中浙金钱草的相似度最高,其共有峰相对峰面积的RSD值在60.52%-129.02%之间。按聚类分析结果显示,77批金钱草及其混伪品样品可分为五大类,J1-J7聚为第一类,该类为金钱草与浙金钱草样品,L1-L7聚为第二类,该类为连钱草样品,M1-M7聚为第三类,该类为马蹄金样品,X1-X7聚为第四类,该类为积雪草样品,G1-G7聚为第五类,该类为广金钱草样品。18批不同产地金钱草指纹图谱的相似度在0.837-0.955之间,其共有峰的相对峰面积的RSD值在2.78%-20.24%之间,四川产区的样品相似度较高,均在0.9以上,贵州产地样品的相似度为0.837。按聚类分析结果显示,18批不同产地金钱草样品可分为两类,J1-J5聚为第一类,该类为四川地区金钱草样品,J6为第二类,该类为贵州产地金钱草样品。5.在UV法测定总黄酮含量上,优化了总黄酮的提取工艺,金钱草的总黄酮含量明显高于其混伪品药材,平均含量分别为:金钱草>广金钱草>浙金钱草>积雪草>马蹄金>连钱草,同一产地不同批次的样品在总黄酮含量上差异不大,但不同产地的金钱草总黄酮含量有显著的差异,在1.084%-2.621%不等,四川产地的金钱草总黄酮含量明显高于其他产地。金钱草总黄酮对DPPH自由基、羟基自由基均有一定的清除能力,在一定范围内,其清除能力与浓度呈量效关系。6.金钱草ITS2和rbcL序列的长度为444 bp、553 bp,GC平均含量为56.34%、42.70%,种内变异率分别为2.48%、0.90%,分别有10种和4种单倍型序列,且金钱草与其混伪品之间存在着明显的间隔,基于ITS2的浙金钱草种内遗传距离明显小于其他产区;NJ树可将金钱草及其混伪品明显区分开,浙江产区的6个金钱草样品形成一个单独分支。结论以上六种方法均能鉴别金钱草及其常见混伪品药材。其中,植物性状、粉末显微、薄层色谱操作最为方便,具有简单、快捷的特点,但存在分离效果差、自动化程度低等缺点;UV测定总黄酮含量的方法,操作简单,重现性好,但也存在分离效果不明显的缺点;HPLC指纹图谱法能够反映出具体的化学成分信息和特征峰谱信息,但存在着提取、分析复杂,实验耗时、试剂消耗较多,对应软件设备要求高等缺点;分子鉴定技术是目前最为准确的物种鉴别方法,能够实现金钱草灵敏方便、快速准确的批量鉴定,但存在对应软件设备要求高、费用较多等缺点。综上所述,可以针对不同的实验条件及各自的需求,选取较合适的分析方法,达到有效鉴别的目的。