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目的:检测环状RNA circPGD在胃癌组织及胃癌细胞系中的表达差异,分析其异常表达对胃癌细胞转移、增殖、凋亡及自噬等生物学行为的影响,探讨其在胃癌进展过程中的作用及相关分子机制,旨在为胃癌的诊断与治疗提供新的分子标志物。方法:1.运用生物信息学方法分析circ PGD的来源,PCR产物测序分析其是否存在环化位点,序列匹配程度;RNase R酶消化胃癌细胞总RNA,circ PGD收敛引物、发散引物应用普通PCR鉴定其为环状RNA;RNA核质分离后应用实时荧光定量PCR及RNA FISH实验检测circ PGD在胃癌细胞中的定位情况;实时荧光定量PCR方法检测circ PGD在胃癌患者胃癌组织及相应癌旁组织、正常胃上皮细胞GES-1细胞及胃癌细胞系中的表达情况。2.采用小干扰RNA（si RNA）技术在MGC-803胃癌细胞中沉默circ PGD表达,应用Transwell细胞转移实验、细胞划痕愈合实验、CCK-8细胞活力实验、平板克隆形成实验、细胞凋亡实验和激光共聚焦显微镜检测沉默circ PGD后对胃癌细胞转移、增殖、凋亡和自噬等生物学行为的影响;分析不同浓度雷帕霉素诱导MGC-803细胞自噬后对细胞表观和细胞行为等的影响,对circ PGD表达水平的影响。Western blotting分析沉默circ PGD后对胃癌细胞转移、增殖、凋亡、自噬、EMT进程及TGF-β及Hippo信号通路主要蛋白的影响。细胞免疫荧光实验进一步分析MGC-803细胞中沉默circ PGD对信号通路主要蛋白SMAD2/3、p-SMAD2/3、YAP和p-YAP入核情况的影响。MGC-803细胞沉默circ PGD后进行裸鼠皮下瘤实验,分析对细胞增殖能力的影响。3.采用过表达质粒转染进入BGC-823细胞高表达circ PGD,应用Transwell细胞转移实验、细胞划痕愈合实验、CCK-8细胞活力实验、平板克隆形成实验及细胞凋亡实验检测circ PGD高表达对胃癌细胞转移、增殖和凋亡等生物学行为的影响。Western blotting分析circ PGD高表达对胃癌细胞转移、增殖、凋亡、自噬、EMT进程及TGF-β及Hippo信号通路主要蛋白的影响。细胞免疫荧光进一步分析circ PGD高表达对信号通路主要蛋白SMAD2/3、p-SMAD2/3、YAP和p-YAP入核情况的影响。BGC-823细胞过表达circ PGD后经尾静脉注射进入裸鼠体内,分析其对胃癌细胞转移能力的影响。4.运用生物信息学技术预测circ PGD可能海绵吸附的micro RNAs,采用实时荧光定量II PCR检测胃癌细胞中circ PGD异常表达后海绵吸附mi RNAs的表达变化,双荧光素酶实验分析circ PGD和mi R-16-5p之间是否存在结合位点。实时荧光定量PCR检测mi R-16-5p在胃癌组织和相应的癌旁组织中的表达情况,分析其与circ PGD表达的相关性;实时荧光定量PCR分析mi R-16-5p在GES-1细胞和胃癌细胞系中的表达情况,RNA FISH实验检测circ PGD和mi R-16-5p在MGC-803细胞中的定位情况。5.应用mi R-16-5p模拟物及抑制剂分析mi R-16-5p对胃癌细胞转移、增殖和凋亡等生物学行为的影响。分别将circ PGD过表达质粒（pcic R-circ PGD）和mi R-16-5p模拟物（mimics）,circ PGD si RNA（si-circ PGD）和mi R-16-5p抑制剂（inhibitor）共同转染进入胃癌细胞分析两者共同转染对胃癌细胞转移、增殖及凋亡等生物学行为的影响,western blotting分析两者对胃癌细胞EMT、凋亡和TGF-β及Hippo信号通路相关蛋白表达的影响。6.运用生物信息学技术预测mi R-16-5p可能调控的靶基因,western blotting实验和细胞免疫荧光实验检测胃癌细胞中mi R-16-5p和circ PGD异常表达后对ABL2表达的影响,双荧光素酶实验检测mi R-16-5p与ABL2之间是否存在结合位点。7.采用实时荧光定量PCR方法检测ABL2在胃癌患者胃癌组织和相应癌旁组织中的表达差异,分析ABL2在临床标本中表达情况与circ PGD、mi R-16-5p表达的相关性。应用ABL2的小干扰RNA和mi R-16-5p inhibitor、ABL2过表达质粒与mi R-16-5p模拟物共同转染进入胃癌细胞后分析对胃癌细胞增殖、转移及凋亡能力的影响,对胃癌细胞EMT、凋亡和TGF-β及Hippo信号通路相关蛋白表达的影响。8.运用生物信息学技术分析circ PGD可能编码的氨基酸序列,构建circ PGD-219aaFlag载体,western blotting实验检测Flag表达情况。将PGD-219aa序列连接至线性载体作阳性对照,分析其对胃癌细胞转移、增殖和凋亡能力的影响;再次构建编码氨基酸能力缺失质粒（circ PGD-219aa-mut-Flag）,分别与对照组质粒、PGD-219aa质粒和circ PGD-219aa环状质粒转染进入胃癌细胞后分析circ PGD编码的PGD-219aa蛋白对胃癌细胞转移、增殖和凋亡等生物学行为及相关蛋白的影响。结果:1.Circ PGD是由定位于1号染色体上的磷酸葡萄糖酸脱氢酶的9,10,11,12和13五个外显子环化而成,存在环化位点,与hsa＿circ＿0009735序列基本匹配。Circ PGD发散引物能够抵抗核酸内切酶降解,且其在基因组DNA中不能扩增出相应产物,表明其在胃癌细胞中稳定存在,不是由于基因组重排或PCR扩增伪片段。Circ PGD在MGC-803细胞的细胞质和细胞核中均存在。与相应的癌旁组织相比较,circ PGD在胃癌组织表达较高,且与胃癌患者肿瘤大小及淋巴结转移程度有关;与正常胃上皮细胞GES-1细胞相比较,circ PGD在胃癌细胞系中也呈高表达。2.在MGC-803细胞中沉默circ PGD后,转移过膜的细胞数量减少,细胞划痕愈合能力减弱,OD450值降低,形成的细胞集落数量较少、体积较小,细胞凋亡百分率增多;Vimentin、N-Cadherin、SNAIL表达降低,E-Cadherin表达升高,BAX表达升高,MMP2、MMP9和PCNA表达降低,YAP和SMAD2/3无明显变化,p-SMAD2/3和p-YAP表达明显降低;YAP表达无明显变化,p-YAP表达降低且表达出核,SMAD2/3亦无明显变化且p-SMAD2/3减少出核。裸鼠皮下瘤的体积小、重量轻,circ PGD表达降低,mi R-16-5p表达升高,ABL2表达降低,PCNA和MMP2表达降低;沉默circ PGD后ABL2表达降低,EMT、转移增殖及通路等相关蛋白发生相应变化,沉默circ PGD后小鼠皮下瘤组织中ABL2、PCNA、MMP2和MMP9表达均下降。雷帕霉素处理MGC-803细胞后,随着雷帕霉素浓度升高细胞转移增殖能力降低,自噬小体数目增多,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达比值升高,circ PGD表达降低;MGC-803细胞沉默circ PGD后,自噬小体数目升高,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达比值升高。3.过表达质粒pcic R-circ PGD转染进入BGC-823细胞后,与转染pcic R质粒相比较,circ PGD表达升高,细胞转移过膜细胞数量增多,细胞划痕愈合能力增强,细胞活力CCK-8 OD450值升高,细胞克隆数目增多,细胞凋亡比例减少。过表达circ PGD后,Vimentin和N-Cadherin表达升高,E-Cadherin表达量无明显差异,BAX表达水平降低,BCL2表达升高,MMP2、MMP9和PCNA表达水平升高,YAP和SMAD2/3表达无明显变化,p-YAP和p-SMAD2/3表达水平均升高;YAP定位于细胞核,p-YAP表达增多且位于细胞质,SMAD2/3无明显变化,p-SMAD2/3表达增多且转移入核;与对照组质粒相比较,BGC-823细胞转染过表达质粒后,裸鼠体内细胞转移能力增强。4.应用starbase,circ Bank和cancer specific circ RNA database公共数据库发现circ PGD可能海绵吸附的mi RNAs主要包括mi R-143-3p、mi R-16-5p和mi R-4428。HGC-27细胞和MGC-803细胞中沉默circ PGD后,mi R-16-5p表达升高,在BGC-823细胞中过表达circ PGD后,mi R-16-5p表达降低。Circ PGD野生株与mi R-16-5p mimics共同转染进入293T细胞后,萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶比值降低,circ PGD野生株与mi R-16-5p inhibitor共转后萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶比值升高,而突变株与mi R-16-5p mimics和mi R-16-5p inhibitor共同转染进入293T细胞后萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶比值无明显变化,表明IV circ PGD和mi R-16-5p之间存在结合位点。MiR-16-5p与circ PGD共同定位于胃癌细胞MGC-803细胞。与GES-1细胞相比较,mi R-16-5p在胃癌细胞中明显低表达;与癌旁组织相比较,胃癌组织中mi R-16-5p表达明显降低,且与circ PGD表达呈负相关,与胃癌患者的肿瘤大小有关。5.MiR-16-5p能够抑制胃癌细胞的转移与增殖并促进胃癌细胞的凋亡过程。将mi R-16-5p mimics和pcic R-circ PGD共转染进入BGC-823细胞后,mi R-16-5p mimics能够逆转circ PGD过表达质粒对胃癌细胞转移、增殖、凋亡能力及对EMT进程、细胞凋亡和TGF-β和YAP信号通路主要蛋白表达的影响。MiR-16-5p inhibitor和circ PGD小干扰RNA共转染入MGC-803细胞后,MiR-16-5p inhibitor能够逆转si-circ PGD对胃癌细胞转移、增殖和凋亡能力的影响,回复si-circ PGD引起的细胞蛋白改变。6.应用Targetscan、mi RDB和Tar Base三个公共数据库发现ABL2为mi R-16-5p调控的下游靶蛋白之一。MGC-803细胞中转染mi R-16-5p mimics或沉默circ PGD后ABL2表达明显降低,BGC-823细胞中转染mi R-16-5p inhibitor或pcic R-circ PGD后ABL2表达升高,表明ABL2可能为mi R-16-5p调控的靶蛋白。ABL2野生株与mi R-16-5p mimics共同转染进入293T细胞后,萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶比值降低;与mi R-16-5p inhibitor共同转染进入293T细胞后萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶比值升高,而ABL2突变株与mi R-16-5p mimics和mi R-16-5p inhibitor共同转染进入293T细胞后萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶比值差异无统计学意义,表明ABL2和mi R-16-5p之间存在结合位点。MiR-16-5p mimics和pcic R-circ PGD共转染、mi R-16-5p inhibitor和circ PGD小干扰RNA共转染后均能逆转其对ABL2表达的影响。7.与相应癌旁组织比较,ABL2 m RNA在胃癌组织中高表达,且与mi R-16-5p呈负相关,与circ PGD表达正相关;ABL2蛋白水平在胃癌组织中呈明显阳性,与胃癌患者LNM淋巴结转移及TNM分级有关。与GES-1细胞相比较,ABL2在胃癌细胞系中高表达。ABL2小干扰RNA和mi R-16-5p抑制剂、ABL2过表达质粒与mi R-16-5p模拟物共同转染进入胃癌细胞后发现,mi R-16-5p模拟物能够逆转ABL2过表达质粒引起的胃癌细胞转移、增殖和凋亡能力的影响;mi R-16-5p抑制剂能够回复ABL2小干扰RNA对胃癌细胞转移、增殖和凋亡能力的变化。8.运用生物信息学技术预测circ PGD可能编码PGD-219aa蛋白,获得氨基酸序列;将Flag片段插入预测编码氨基酸终止密码子TAA前,命名为circ PGD-219aa-Flag,转染进入293T细胞后,Flag蛋白可表达。将其编码的氨基酸序列连接至线性载体（命名为PGD-219aa-Flag）中,转染进入MGC-803和BGC-823细胞,发现其可促进胃癌细胞转移、增殖并抑制凋亡。将circ PGD-219aa-Flag、circ PGD-219aa-mut-Flag（氨基酸编码能力缺失质粒）和PGD-219aa-Flag与对照质粒载体分别转染进入胃癌细胞后发现circ PGD-219aa-Flag和PGD-219aa-Flag可表达Flag,且与对照质粒相比较,其能够明显促进胃癌细胞的增殖和转移能力,抑制细胞凋亡;而Vector和氨基酸编码缺失质粒circ PGD-219aa-mut-Flag转染的MGC-803和BGC-823细胞不表达Flag蛋白,circ PGD-219aa-mut-Flag对胃癌细胞的增殖、转移和凋亡能力影响较弱。结论:环状RNA circ PGD可通过mi R-16-5p/ABL2靶轴和编码一个新的跨环化位点的219aa蛋白（PGD-219aa蛋白）,调节SMAD2/3及YAP信号通路诱导EMT进程,促进胃癌细胞转移和增殖,抑制胃癌细胞凋亡和自噬等生物学过程,有望成为临床胃癌诊断与治疗的新的分子标志物。