等温扩增技术操作简单,能够在恒定温度下实现核酸扩增过程,对温度控制要求较低,很好地弥补了传统的聚合酶链反应(PCR)的不足,因此,在病原体和miRNA检测,单核苷酸多态性,DNA甲基化等核酸分析中的应用得到了快速发展。随着适配体,DNAzyme等功能核酸分子的引入,等温扩增技术的应用范围已经拓展到了蛋白,细胞,功能小分子,金属离子等分析检测领域。目前,已经建立了很多种等温扩增技术,其中基于滚环扩增(RCA)和切刻酶辅助的等温扩增技术,设计和扩增体系简单,灵活性和可操作性很强,易于和其他的信号放大技术和检测体系整合在一起,因此,广泛应用于各种类型的生化分析体系。本论文围绕基于等温扩增技术和功能核酸分子的生化分析体系展开,主要包括以下五部分:第一章首先简要介绍了常用的各类等温扩增技术的原理和应用。然后总结了基于等温扩增技术的生化分析中常用的功能核酸分子和信号读出手段。最后着重介绍了基于RCA和切刻酶辅助的等温扩增技术在各类分析物检测中的应用以及在实际样本检测中的问题,并在此基础上,提出了本论文的研究思路和主要内容。在第二章中,我们结合切刻酶辅助的链置换扩增和指数滚环扩增,设计了一种简单的等温扩增方法,用于检测HPV基因组DNA。充分利用HPV基因组上存在的多个切刻位点和链置换扩增反应,可以产生包含特异性序列的单链DNA,用于引发后续的RCA反应。在整个扩增反应过程中,无需额外的核酸引物,也不需要加热变性等预处理。同时,由于反应体系所需的试剂和反应温度是兼容的,因此,整个扩增反应能够一步进行。选取最常见的3种HPV亚型,HPV11,16,18,作为模型,评价了该方法用于HPV基因分型的特异性。此外,该方法能够应用于Hela细胞中HPV18的检测。在第三章中,我们借助快速磁分离技术和简便的滚环扩增技术,设计了一种简单高效,成本低廉的miRNAs检测方法。该检测方法最主要的部分是鱼钩式探针功能化的磁珠。设计的鱼钩式探针锚定在磁珠上,用于识别和捕获待测的miRNAs,同时,通过简单的磁分离,把待测的miRNAs从样品基质中分离出来。通过简单的磁分离,可以去除过量的探针和干扰核酸的影响,因此,体系的非特异性扩增和背景信号得到有效抑制。基于此方法,可以实现单碱基错配链的区分,而且,不用提取总RNA,就可以完成MCF-7细胞裂解液中miR-21的检测。在第四章中,我们结合DNAzyme依赖铅离子的特异性切割活性和RCA信号放大技术,设计了包含DNAzyme切割底物链的环形模板,发展了一种RCA应用的新模式。并在此基础上,设计了一种简单廉价的均相荧光分析方法用于铅离子检测。采用生物素标记的底物链,通过简单的磁分离将铅离子辅助切断的产物片段和未切割的片段分离开来,从而将铅离子浓度转换为切断的产物片段浓度。由于初始核酸探针浓度较高,通过短时间的RCA即可实现有效信号放大。铅离子辅助的DNAzyme切割反应和RCA反应均在均相溶液中进行,有利于提高反应效率,进而获得高的检测灵敏度。同时,评价了常见干扰离子和水体基质的影响,结果表明该方法检测铅离子的选择性好,基体干扰小,能够用于实际样本的检测。第五章,简要总结了本论文完成的主要工作,同时提出了需要进一步完善的研究内容和后续的研究计划。