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研究背景:骨代谢紊乱包括骨形成和骨吸收过程的不调,骨吸收障碍可导致骨质硬化症,而骨形成不足会引起骨质疏松症。骨质疏松症患者的骨密度降低、骨量减少、骨小梁排列紊乱的特点也给其缺牙种植修复、错牙合畸形正畸矫治等口腔临床治疗带来了诸多问题,严重影响着患者的健康和生活质量。甲状旁腺素(PTH)是体内调节骨代谢的重要激素之一,已有研究表明持续性给予PTH刺激可造成骨量丢失及骨密度降低,而间断性给予PTH刺激可使骨密度及骨强度显著增高,其具体机制复杂而不明确。Cl C-3氯通道是一类电压门控型的离子通道,然而Cl C-3基因敲除小鼠表现出生长阻滞及骨发育的异常,着提示我们Cl C-3氯通道可能与骨发育和骨代谢有关。我们课题组前期研究发现,Cl C-3氯通道存在于成骨细胞中,具有增强细胞体外矿化能力及促进成骨分化的作用。既然PTH和Cl C-3氯通道在骨代谢过程中都具有促进骨形成的作用,那么研究二者在成骨分化过程中是否具有某种内在的联系就具有重要的意义。研究目的:本研究旨在通过观察在不同浓度及不同给药方式的PTH刺激下,MC3T3-E1细胞中Cl C-3氯通道及成骨相关基因的表达变化,并通过干扰Cl C-3氯通道的表达来初步探索成骨细胞中Cl C-3氯通道在PTH的促进成骨分化过程中的作用,为PTH在促进成骨作用的机制研究提供新的思路。研究内容:(1)研究不同浓度及不同给药方式的PTH刺激对MC3T3-E1细胞增殖能力及其成骨相关基因表达的影响。(2)研究PTH刺激对MC3T3-E1细胞中Cl C-3氯通道表达的影响。(3)初步探究Cl C-3氯通道在PTH促成骨分化中的作用。研究方法:(1)通过CCK-8试剂盒法检测不同实验分组的MC3T3-E1细胞的增殖情况,同时利用Real-Time PCR法检测MC3T3-E1细胞中成骨相关基因Alp、Runx2的表达情况。(2)通过Real-Time PCR方法及细胞免疫荧光法检测PTH刺激对Cl C-3氯通道表达的影响,初步分析两者之间的关系。(3)利用免疫荧光方法检测不同Cl C-3氯通道表达水平的MC3T3-E1细胞在PTH刺激下Cl C-3氯通道蛋白的变化情况,利用Real-Time PCR检测各组细胞中成骨相关基因及Clcn3的表达情况,并进一步观察各组细胞体外矿化能力的变化。研究结果:(1)10-9 M的PTH间断刺激下,MC3T3-E1细胞中Alp、Runx2的表达最显著。(2)10-9 M的PTH间断刺激时,MC3T3-E1细胞中的C l C-3氯通道表达量在各实验组中最强。(3)10-9 M的PTH刺激MC3T3-E1细胞,C l C-3 si RNA干扰组比C l C-3氯通道正常表达组的成骨相关基因表达量明显降低,同时,体外矿化能力也减弱。结论:(1)合适浓度的PTH间断刺激有促进成骨细胞成骨分化作用。(2)MC3T3-E1细胞中的Cl C-3氯通道能够响应PTH的刺激发生变化。(3)Cl C-3氯通道介导了PTH对成骨细胞的促成骨分化作用。