β-二酮钴的配合物抗胶质瘤细胞作用的实验研究及机制探讨研究背景:脑胶质瘤是神经系统中发病率最高的肿瘤,同时也是死亡率最高的神经系统肿瘤,其死亡率接近发病率,同其他恶性肿瘤一样,手术、放疗、化疗是其治疗的主要手段。然而因其病理学上恶性行为的突出表现(即浸润性生长),及其显微手术都难以将其全切的特点,预示其预后不佳,因此术后的放化疗在脑胶质瘤的治疗过程中有着重要意义。研究表明脑胶质瘤具有一定的抗辐射性,故放疗在胶质瘤治疗上的获益有限。当前脑胶质瘤治疗研究领域中,以化疗最为活跃。目前替莫唑胺在胶质瘤治疗中的地位得到承认,然而大量的研究结果显示替莫唑胺的作用仍不能让人满意,因此研发新型、高效、低毒的抗胶质瘤药物迫在眉睫。随着多学科协作、合作的不断深入,医学与化学交织,利用各种新型化合物解决医学难题的研究层出不穷,化学金属配合物与DNA作用的研究不断涌现,尤其小分子与DNA之间的相互作用常常会诱发许多生物效应,其意义影响深远。钴是一种高熔点、稳定性良好的磁性硬金属。正常人体的钴含量为1.1～1.5mg,其中14%分布于骨骼中,43%分布于肌肉中,余下的分布于人体其它软组织中。在探讨含钴化合物的抗肿瘤活性研究进展中,我们发现多种含钴配合物都对肿瘤细胞表现出明显的抑制作用,其抗癌活性的发挥主要表现在其与DNA之间的相互作用。因此研发新型的含钴配合物在胶质瘤治疗领域将具有重要的现实意义。β-二酮作为螯合剂,具有广泛的螯合能力, Jensen于1959年首次合成,并对其螯合作用进行了研究,研究结果表明其对金属具有良好的螯合作用。针对上述特点,我们通过以下实验对β-二酮-钴这一新型的金属配合物在抗胶质瘤方面的作用进行深入的探讨,期待寻找出新型、高效、低毒的抗胶质瘤药物。研究目的:旨通过实验,探讨β-二酮钴的配合物对脑胶质瘤的抑制作用及作用机制,为其临床抗胶质瘤的研究提供有力的实验依据和理论基础,为开发新型抗胶质瘤药物扩展新视野。研究方法及结果:1通过体外敏感性实验探讨β-二酮的钴配合物对胶质瘤细胞的增殖抑制作用。化合物经体外抗肿瘤活性初筛后,选择抗肿瘤活性较高的β-二酮的钴配合物作为受试化合物,采用MTT法检测β-二酮的钴配合物作用C6大鼠脑胶质瘤细胞株的细胞生长抑制率。检测结果表明:与阴性对照组相比,在浓度为6.25～100μg/mL时,β-二酮的钴配合物对C6大鼠脑胶质瘤细胞株有明显的抑制作用(p<0.05),且随着浓度的升高,抑制作用更加明显,抑制率最高可达83.1%(100μg/ml)。与阳性对照组相比,在相同浓度下,β-二酮的钴配合物对胶质瘤细胞株抑制作用较细胞毒性药物氟尿嘧啶强。2β-二酮的钴配合物的急性毒性动物实验选择成年健康昆明种小鼠80只,完全随机将分成8组,并给予不同浓度受试药物(根据预实验结果确定浓度),观察小鼠2周的状态和反应,记录小鼠的中毒表现及动物的死亡数量和时间,并对小鼠内脏行病理剖检和组织学观察。结果显示:给药后6小时开始出现死亡,死亡前小鼠出现昏睡、皮毛无光泽、体重减轻等中毒症状;病理解剖及组织学观察发现其肝脏及肠道等脏器有不同程度的损伤。按Bliss法,计算该化合物LD50为3099.1mg/kg。3探讨β-二酮的钴配合物对C6大鼠脑胶质瘤细胞DNA合成的抑制作用将进入对数生长期的C6大鼠脑胶质瘤细胞铺于96孔培养板上,分组加入受试药物及3H -TdR,合理培养后烤箱烘干,加入闪烁液,测定cpm值,计算胶质瘤细胞抑制率。实验结果显示:β-二酮的钴配合物对C6大鼠脑胶质瘤细胞DNA合成有明显的抑制作用,且呈剂量效应关系,最高抑制率近50%。4探讨β-二酮的钴配合物对C6大鼠脑胶质瘤细胞株细胞周期的影响采取流式细胞术,测定细胞周期各时相细胞百分数,对β-二酮的钴配合物对C6大鼠脑胶质瘤细胞株细胞周期的影响进行分析。实验结果显示:实验组处于S期的百分率明显高于对照组(P<0.01),但随着给药时间及浓度的改变,S期细胞比例无明显趋势性变化。5探讨β-二酮的钴配合物对C6大鼠脑胶质瘤细胞株细胞凋亡的影响将C6大鼠脑胶质瘤细胞用不同浓度β-二酮的钴配合物作用后,DAPI染色,置于显微镜下观察细胞的形态及生长密度变化。结果显示:实验组细胞形态研究方法及结果:学变化表现为细胞密度减低,细胞体积变小,部分细胞收缩呈圆形,并可见细胞碎片。荧光染色后观察,实验组可见核呈致密浓染强荧光表现的凋亡细胞,高度浓度组还可见到颗粒块状DNA荧光碎片细胞,即有核碎裂表现的凋亡细胞。采用Annexin V和PI双染流式细胞术检测β-二酮的钴配合物对胶质瘤细胞细胞凋亡的影响,结果显示:实验组细胞发生凋亡的百分率明显高于对照组,随着给药浓度的增加,细胞凋亡率逐渐提高,随着作用时间的延长,凋亡率也提高,即对凋亡率的影响具有时间及剂量效应。6探讨β-二酮的钴配合物作用C6大鼠脑胶质瘤细胞对细胞凋亡因子表达的影响采用Western blot免疫印迹分析β-二酮的钴配合物作用48h后脑胶质瘤细胞的Bcl-2、Bax蛋白表达。结果显示:随着β-二酮的钴配合物浓度的增加,Bcl-2蛋白表达量随着降低,而Bax蛋白表达量随着增高。结论:1.β-二酮的钴配合物对胶质瘤细胞的生长有明显的抑制作用,且存在剂量-效应关系;2.β-二酮的钴配合物为低毒化合物,肾损害小,毒性靶器官为肝脏及肠道;3.β-二酮的钴配合物能阻止胶质瘤细胞DNA合成,从而抑制胶质瘤细胞的复制及增殖;4.β-二酮的钴配合物通过使胶质瘤细胞阻滞于S期的机制,抑制胶质瘤细胞进入下一增殖周期,从而抑制胶质瘤细胞增殖;5.β-二酮的钴配合物有诱导细胞凋亡的作用;6.β-二酮的钴配合物抗肿瘤机制与诱导促凋亡因子Bax的表达,减弱凋亡抑制因子Bcl-2的表达密切相关。以上结论说明,β-二酮的钴配合物在体外实验中表现出较强的抗脑胶质瘤细胞的作用,在探讨其抗胶质瘤作用机制的研究中我们发现,其作用与影响胶质瘤细胞DNA合成、细胞阻滞、诱导细胞凋亡及影响细胞凋亡因子的表达密切相关,然而其确切的分子基础仍待进一步研究。