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刺参(Apostichopus japonicus)是我国重要的名贵海珍产品,随着刺参养殖规模不断的扩大,养殖刺参出现种质资源退化、抗病能力显著下降以及由水温和盐度等因素导致的减产、病害以及生长缓慢等问题。特别是在雨季时,地处江河附近的刺参池塘极易受到降雨影响而导致海水盐度降低,造成刺参大量的发病和死亡,给刺参养殖业造成极大的经济损失。本文通过刺参的溶菌酶基因(lysozyme gene,LYZ)、Na+,K+-ATPase基因(Na+,K+-ATPase gene,NKA)及NKCC1基因等的体内RNA干扰试验,研究其在刺参盐度适应性状中的功能,为刺参健康可持续养殖奠定基础。(1)本研究中分别构建了溶菌酶基因的Rip-LYZ-1、Rip-LYZ-2、Rip-LYZ-3,Na+,K+-ATPase基因的Rip-NKA-1、Rip-NKA-2、Rip-NKA-3和NKCC1基因的Rip-NKCC-1、Rip-NKCC-2、Rip-NKCC-3 RNA干扰重组质粒。以培养的刺参体腔液原代细胞为靶细胞检测RNA干扰重组质粒对其靶基因的沉默效率,通过测定其靶基因的相对表达量和酶活性变化来筛选最佳干扰质粒。结果显示:Rip-LYZ-1、Rip-LYZ-2和Rip-LYZ-3的沉默效率为40%、45%、0%,Rip-NKA-1、Rip-NKA-2和Rip-NKA-3的沉默效率为32%、46%、39%,Rip-NKCC-1、Rip-NKCC-2和Rip-NKCC-3的沉默效率为18%、51%、11%;此外,Rip-LYZ-2和Rip-NKA-2均对其靶基因的表达量和酶活性产生了极为显著的(P<0.01)抑制作用。上述结果为后续的刺参体内RNA干扰试验提供了重要的参考依据。(2)为了探索刺参体内RNA干扰的方法,本试验以Rip-LYZ-2为干扰质粒进行LYZ基因的体内RNA干扰。分别以口腔注射和体腔注射的方式转染等量的Rip-LYZ-2,48小时后提取刺参体腔液、肌肉和管足组织用于测定各试验组LYZ基因的表达量变化情况。结果显示:口腔注射组中,体腔液、肌肉和管足中LYZ基因的相对表达量分别为0.58、0.24和1.6;腹腔注射组中,体腔液、肌肉和管足中LYZ基因的相对表达量分别为1.3、560和0.27。表明从口腔注射RNA干扰重组质粒能够获得更为稳定的RNA干扰效应和更高的沉默效率。接下来以口腔注射的方式分别注射0.5μg、5μg、10μg和25μg的Rip-LYZ-2。48小时后提取刺参体腔液、肌肉和管足组织用于测定各试验组LYZ基因的表达变化情况。结果显示:注射剂量为0.5μg时,刺参体腔液、肌肉和管足LYZ基因的相对表达量分别为1.38、2.69和4.92;注射剂量为5μg时,刺参体腔液、肌肉和管足LYZ基因的相对表达量分别为2.24、0.78和4.55;注射剂量为10μg时,刺参体腔液、肌肉和管足LYZ基因的相对表达量分别为0.08、1.17和0.15;注射剂量为25μg时,刺参体腔液、肌肉和管足LYZ基因的相对表达量分别为0.6、0.13和0.04。表明:当RNA干扰重组质粒的注射剂量达到10μg及以上时,对刺参体内靶基因的表达形成了较为稳定的RNA干扰效应。最后,以口腔注射的方式转染Rip-LYZ-2,并分别在转染后0 h、12 h、24 h、48 h、4 d和8 d后提取刺参体腔液、肌肉、体壁、疣足和管足组织,对LYZ基因表达量和溶菌酶活性进行测定。结果显示:体腔液和肌肉中LYZ基因表达量在前48 h呈下降趋势,之后其表达量快速上升,体腔液中溶菌酶活性则持续下降,肌肉中溶菌酶活性一开始即上升,而在24 h和48 h未检测到溶菌酶活性,之后溶菌酶活性快速上升;体壁中LYZ基因表达量及其酶活性的变化趋势基本一致,总体上呈先上升后下降再上升的趋势;疣足中LYZ基因表达量及其酶活性在前48 h未出现显著变化,并分别在48 h达到最小值,之后开始回升;管足中LYZ基因的表达量在12 h显著上升(P<0.05),之后其表达量快速下降,并于48 h后逐步回升,其酶活性一开始即快速上升,在12 h后酶活性持续下降。表明刺参的RNA干扰效应具有系统性,即局部注射干扰质粒能够在动物个体的不同组织和器官引起靶基因表达的降低,且mi RNA介导的刺参体内RNA干扰效应能够持续四天左右。(3)分别进行低盐胁迫条件下LYZ、NKA和NKCC1基因的体内RNA干扰实验。在转染后0 h、12 h、24 h、48 h、72 h和96 h抽取刺参体腔液用于测定基因的表达变化情况。结果显示:LYZ试验组的LYZ基因表达量在24 h和72 h时显著低于对照组(P<0.05),而其酶活性在24 h和48 h时亦显著低于对照组(P<0.05),NKA和NKCC1的表达量显著低于对照组(P<0.05);NKA试验组的NKA基因表达量在12 h和24 h时显著低于对照组(P<0.05),其酶活性在24 h和96 h时显著低于对照组(P<0.05),NKCC1的表达量在12 h到72 h间显著低于对照组,LYZ的表达量和酶活性在部分时刻亦低于对照组;NKCC试验组NKCC1和NKA的表达量分别在前48 h和24 h显著低于对照组;此外,通过测定各对照组和试验组刺参体腔液中Na+、K+和Cl-的浓度表明:各试验组刺参体腔液细胞调节渗透压的能力降低。进一步验证了LYZ、NKA和NKCC1基因在刺参盐度适应中的功能,且这三者之间存在复杂的互作机制。