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慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一类起源于骨髓造血干祖细胞的恶性克隆增殖性疾病。由9号染色体和22号染色体易位形成的bcr/abl融合基因在该病的发生和进展过程中发挥着重要的作用。该融合基因所表达的BCR/ABL融合蛋白具有持续性激活的酪氨酸激酶活性,可激活下游多条信号通路并导致髓系细胞的恶性增殖。Hippo通路是在果蝇体内发现的一条信号转导通路,其主要功能是通过促进细胞凋亡和限制细胞过度增殖进而调控器官体积、保持细胞增殖凋亡平衡并参与调节细胞的接触性抑制等。YAP是该通路关键的效应因子,它作为一种转录辅因子,可与TEAD和Smad等多种转录因子结合,从而调控下游c-myc和survivin等基因的表达。YAP表达和定位的异常与多种肿瘤的发生及恶性程度相关。虽然YAP在调节细胞增殖与凋亡方面发挥着重要的作用,并且其靶基因c-myc和survivin与CML的急变及患者的预后密切相关,但是在CML这种恶性血液系统疾病中该蛋白的表达及作用机制尚不清楚。本课题拟从检测CML病人与正常对照以及BCR/ABL-与BCR/ABL+细胞株中YAP的表达差异入手,初步探讨YAP是否受BCR/ABL的调节,并在此基础上分析靶向抑制YAP对CML细胞株生物学效应及k562细胞致小鼠白血病成瘤能力的影响及其机制。旨在为cml的靶向治疗提供新的思路。主要研究方法:1.分别检测不同时期cml患者(cp、ap以及bp)和正常对照(n)组骨髓单个核细胞标本中yap蛋白的表达情况,初步了解yap与cml的关系;检测bcr/abl-细胞株(hl60、thp1、nb4)、bcr/abl+细胞株(k562、kcl22、k562/g01)、p210bcr/abl转化前(baf3、32d)和转化后细胞株(bp210、32dp210)中yap的mrna和蛋白水平,了解bcr/abl与yap的关系;用im处理cml细胞株k562和k562/g01,研究抑制bcr/abl激酶活性对yap表达、定位、蛋白稳定性以及其下游靶基因c-myc和survivin表达的影响;分别使用bcr/abl下游通路(mek-erk和pi3k/akt信号通路)的抑制剂u0126、pd98059和ly294002处理细胞,初步探讨bcr/abl调节yap的机制。2.分别采用小干扰rna和小分子抑制剂维替泊芬(verteporfin,vp)处理两种方法,抑制k562和k562/g01细胞中yap功能的发挥,同时联合im与vp,通过体外实验观察对cml细胞生物学效应的影响及作用机制。分别通过mtt实验检测细胞增殖情况;流式细胞术(flowcytometer,fcm)分析对细胞周期和凋亡的影响;瑞氏染色观察细胞形态变化;westernblot检测下游基因c-myc,survivin以及细胞周期和凋亡相关蛋白的表达。3.构建k562-nod/scid小鼠血液瘤模型,观察对照组、im、vp以及im联合vp处理组小鼠的一般情况、外周血中wbc、cd45+白血病细胞的百分率以及生存期;对出现明显发病症状的濒死期小鼠进行颈椎脱臼法处死,观察小鼠肝、脾、肺等脏器的大小并拍照,记录各脏器重量;4%多聚甲醛固定后,石蜡包埋,切片,he染色观察肝、脾等组织中白血病细胞的浸润情况;瑞氏染色观察骨髓象的变化;定量pcr检测骨髓细胞中c-myc和survivin的mrna水平的变化。实验结果与结论:1.在cml患者骨髓单个核细胞中yap蛋白水平明显高于正常对照组;bcr/abl+细胞株(k562、kcl22、k562/g01)中yap的蛋白表达明显高于bcr/abl-细胞株(hl60、thp1、nb4);与baf3、32d相比,p210bcr/abl转化细胞株bp210和32dp210中yap的蛋白表达明显增高但是mrna水平无明显差异;bcr/abl抑制剂im能够下调yap的蛋白水平,但是对mrna无影响;im能够通过泛素蛋白酶体途径加快yap的降解并且能够减少yap的入核,从而抑制其下游靶基因c-myc和survivin的表达;mek-erk信号通路的抑制剂u0126可以降低yap的蛋白水平。2.在cml细胞株k562和k562/g01中,采用sirna技术干扰yap的表达,可以抑制细胞的增殖,促进细胞的凋亡,同时使细胞周期阻滞于g1期。并能够明显抑制hippo通路下游c-myc和survivin的表达,下调周期相关蛋白cyclind1的表达,上调p21和bax的表达,同时使凋亡相关蛋白parp及caspase3的活化增多。另外,使用yap-tead的小分子抑制剂vp处理k562和k562/g01,同样能够抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、将细胞周期阻滞于G1期,并且VP与IM联合应用能够增强IM的作用。3.在K562-NOD/SCID小鼠模型中,与对照组相比,IM和VP单独处理组及联合处理组小鼠的发病时间及生存期明显延长,体重减轻和外周血白细胞增高的速度减慢,肝脾肿大及白血病细胞浸润情况有明显改善,并且联合处理组作用最为明显,骨髓细胞中c-myc和survivin的mRNA水平有所降低。综上所述,本课题发现YAP蛋白在CML患者骨髓单个核细胞中的表达高于正常对照组;BCR/ABL+细胞株中YAP的蛋白表达明显高于BCR/ABL-细胞株;BCR/ABL通过影响YAP的蛋白稳定性及细胞定位参与了对YAP蛋白水平的调节,其下游的MEK-ERK信号通路可能参与了该过程;体外抑制YAP能够通过下调c-Myc、survivin和cyclinD1,上调p21、Bax、cleaved-caspase3及cleaved-PARP的水平,抑制CML细胞的增殖并促进细胞凋亡;YAP抑制剂VP能明显延长K562-NOD/SCID模型小鼠的发病时间及生存期。本课题的意义在于:首次在CML中研究了YAP蛋白的表达并初步探讨了BCR/ABL对YAP的调节机制,通过体内外实验研究YAP对CML细胞的生物学效应的影响及相关机制,为CML的治疗提供了一个新的靶点,同时也为临床联合用药奠定了一定的理论基础。