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谷类作物种子内淀粉的积累对于作物产量的形成具有极为重要的意义。种子淀粉的生物合成是各种酶催化的过程,这一模型已经初步建立。然而随着越来越多的该模型外的粉质突变体基因的发现,新的多网络交叉模型的建立显得尤为重要。为寻找淀粉合成相关的新基因,我们对实验室已有的日本晴T-DNA插入突变体库和日本晴、93-11辐射诱变突变体库进行了筛选(总共筛选11400份变突变体材料),并鉴定到多份粉质突变体。本文针对其中的一个突变体——T3612,进行详细研究,并取得如下研究进展：T3612种子外观及横截面呈现不透明粉质表型,与野生型日本晴相比较千粒重下降33.7%；突变体种子横截面扫描电镜观察结果显示,T3612淀粉颗粒变圆、变小,而且排列疏松；突变体种子生理生化测定结果显示,蛋白质和脂肪含量上升大约15%,直链淀粉含量是野生型的80%。通过图位克隆的方法,利用T3612/南京11F2群体中1242个粉质表型极端个体,将目的基因定位于第11染色体短臂25cM处,位于OSJNBa0058P12BAC克隆的T3612-54和T3612-31两个标记间的61kb区域。经RICEGAAS预测该区间有11个基因,RT-PCR表明该区间PDIL1-1未表达。基因组序列测序表明PDIL1-1从ATG后124bp处开始总共缺失4145bp。功能互补实验进一步证实了我们所克隆到的基因PDIL1-1就是控制突变性状的关键基因。利用半定量RT-PCR和western blot进行组织表达模式分析,结果表明PDIL1-1呈现组成性表达,在根、茎、叶、鞘、穗和胚乳中均有表达,而且在发育12天的胚乳中表达量最高。但是在突变体T3612中,不论是在RNA水平还是蛋白水平均检测不到PDIL1-1的表达。这进一步确证粉质突变体T3612确实是PDIL1-1缺失型突变体。我们利用荧光定量PT-PCR的方法,检测了31个淀粉合成相关基因的表达情况。与野生型比较,突变体中OsAGPL2、OsPHOL、OsSuSy2和OsSuSy3的表达增加了将近1倍；另外OsAGPL1、OsAGPL4、OsSSIIB,OsPHOH和OsDPE-1的表达降低至野生型的一半。利用非变性淀粉胶电泳后活性染色的方法,我们检测了突变体发育9天和12天胚乳中淀粉合成酶(starch synthase, SS)、淀粉分支酶(branching enzyme, BE)、淀粉磷酸化酶(Starch Phosphorylase, Pho)和淀粉脱分支酶(debranching enzyme, DBE)的活性。活性染色结果显示,普鲁兰酶的活性下降,而且突变体普鲁兰酶条带迁移率下降,ISA的活性没有明显差异；SSⅠ的活性显著上升,而SSⅢ的活性变化不明显；Pho1的活性显著下降,Pho2的活性没有变化；淀粉分支酶的活性均未变化。另外ADPG焦磷酸化酶(AGPase)和蔗糖合酶(Sucrose Synthase)的活性显著增加,UDPG焦磷酸化酶(UGPase)活性变化不大。除此之外,我们利用基于DNA测序的荧光糖电泳(DSA-FACE)的方法测定了突变体种子中支链淀粉链长分布特征。结果8≤DP≤13的链长比例增加,6≤DP≤7的链长比例降低。PDIL1-1编码一个蛋白质二硫键异构酶。体外表达PDIL1-1重组蛋白并进行酶活实验分析,表明我们克隆到的重组PDIL1-1蛋白可以还原胰岛素,而且还原活性与PDIL1-1蛋白的浓度成正比。另外,重组PDIL1-1在体外可以有效地抑制柠檬酸合酶的热变性,说明其具有分子伴侣活性。PDIL1-1通过对底物蛋白二硫键的氧化还原,可以帮助其形成正确构象。荧光定量RT-PCR检测分析发现突变体胚乳细胞中Bip、Hsp70、Hsp90、CRT、CNX等分子伴侣基因,NEF、ERdj3like、Stt3a和UDPG-glucose-transporteor等辅助分子伴侣基因,bZIP转录因子基因bZIP60和ERAD降解途径基因Derlins的表达量均高于野生型。这些基因受内质网胁迫(ER stress)所诱导表达,这说明突变体胚乳细胞内发生内质网胁迫。内质网胁迫可使细胞启动程序性死亡(PCD),本研究中RT-PCR检测PCD相关基因HSR203J在突变体胚乳细胞中的表达明显高于野生型。因此我们推断突变体胚乳细胞内发生严重内质网胁迫从而诱发PCD,进一步影响了胚乳细胞内的淀粉积累。