丁二酮是具有强烈奶油香味的国家标准允许使用的香料,在乳制品和需要奶味的非乳制品中都起着加香的重要作用。在已有的生产方法中,天然提取法原料来源少、提取价格昂贵；化学法虽然丁二酮产量高但是产品纯度低、使用不安全、对环境造成污染；微生物发酵法生产周期短、菌种来源广泛、产品质量相当于“天然产品”,但是产量低难以进行工业生产。因此微生物发酵法是生产丁二酮最有潜质的方法,成为研究人员的研究焦点。本课题选择肺炎克雷伯氏菌CICC10011作为出发菌株,通过代谢工程得到重组菌株,然后进行发酵培养测定产品的产量变化。在代谢工程中,选择关键酶α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC)进行基因改造,分别过表达和敲除ALDC,研究重组菌的表现型,进而分析α-乙酰乳酸脱羧酶在代谢途径中的功能。在基因过表达的实验中,以肺炎克雷伯氏菌CICC10011基因组作为模板,利用PCR扩增得到ALDC基因；然后引入适当的酶切位点扩增、插入载体PBR322中,得到表达载体PBR322-ALDC；将表达载体电转化到肺炎克雷伯氏菌CICC10011中；通过四环素抗性筛选出重组菌株。对野生菌株和重组菌株进行发酵培养并测定产物的产量变化和酶活变化,结果显示：重组菌与野生菌的2,3-丁二醇产量相当,发酵80g/L葡萄糖,产量可达37g/L；重组菌株产生乙偶姻的能力明显高于野生菌株,产量达13.11g/L,其转化率为16.4%,比野生菌株产量提高了28%；两种菌株均不产丁二酮；重组肺炎克雷伯氏菌中α-乙酰乳酸脱羧酶的酶活力达到0.173U/mg,是出发菌株的1.6倍。综上可知,过表达ALDC后使其直接产物乙偶姻产量提高,并没有经过非酶氧化途径产生丁二酮。在基因敲除的实验中,利用重叠PCR技术得到重组基因片段(上游ALDC+amp+下游ALDC);将重组基因电转化到野生型肺炎克雷伯氏菌感受态细胞中,氨苄抗性筛选出重组菌株。对野生菌株和重组菌株进行发酵培养并测定产物的产量变化和酶活变化,结果显示：野生菌不产丁二酮,而重组菌株产生了0.14g/L的丁二酮；重组菌株产生乙偶姻的能力明显低于野生菌株,产量为2.21g/L,比野生菌株产量降低了78.4%；重组菌几乎不产生2,3-丁二醇并且其α-乙酰乳酸脱羧酶的酶活力也几乎为零。综上可知,敲除ALDC后促进了α-乙酰乳酸进行非酶氧化生成丁二酮,并且对副产物乙偶姻、2,3-丁二醇等的产生有重要的影响。总之,野生菌和过表达菌都不产丁二酮,过表达菌乙偶姻产量增加,说明野生菌和过表达菌代谢途径中非酶氧化途径很弱,过表达菌直接影响到乙偶姻的产量,乙偶姻增加也并没有产生丁二酮,乙偶姻到丁二酮的代谢支路中的乙偶姻氧化酶活性很低或者不存在。敲除菌有少量丁二酮的产生,乙偶姻减少,几乎不产生2,3-丁二醇,这表明敲除ALDC后使非酶氧化途径增强,从而产生了少量的丁二酮,丁二酮通过丁二酮还原酶产生少量乙偶姻；而产生的乙偶姻的量不足以使代谢流向2,3-丁二醇,此外敲除ALDC后也可能影响到了代谢途径中的氧化还原体系,导致没有2,3-丁二醇的积累。