利用酵母细胞生物转化法合成天然2-苯乙醇的研究

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2-苯乙醇是一种具玫瑰气味的芳香醇,作为香料广泛用于食品、日化和轻工等领域。人们对天然香料消费需求的日益增长,推动了利用生物技术方法生产天然2-苯乙醇的研究。以发酵法或酶法生产的L-苯丙氨酸为前体,利用酵母细胞将其转化为2-苯乙醇,产品具有天然属性,可以取代从玫瑰或其它植物精油中提取的天然2-苯乙醇,具有广阔的开发前景。本文以提高2-苯乙醇转化浓度和生产率为目标,从上、中、下游系统地研究了2-苯乙醇转化合成工艺,大幅度提高了2-苯乙醇的转化浓度和生产率,为生物转化法合成天然2-苯乙醇的工业化应用奠定了良好的基础。从15个酵母菌株中,筛选出1株对2-苯乙醇耐受性强、转化合成2-苯乙醇浓度高的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BD菌株,对其进行纯化并结合紫外诱变,得到酿酒酵母BD18菌株,在未经优化的培养基中,该菌株转化合成2-苯乙醇浓度达到2.04g/L,是1株适用于2-苯乙醇的生物转化合成的理想菌种。采用单因素试验和正交试验,优化了转化合成2-苯乙醇的培养基组成、种子培养基组成和转化培养条件,使得2-苯乙醇浓度有大幅度提高。摇瓶转化合成2-苯乙醇的最佳工艺是:种子培养基组成为葡萄糖40g/L、蛋白胨20g/L、酵母浸出粉10g/L,装量为40mL/250mL三角瓶;转化培养基组成为蔗糖120g/L、酵母浸出粉5g/L、KH2PO4 7.5g/L、K2HPO4 9.6g/L、MgSO4·7H2O 0.5g/L,装量为30mL/250mL三角瓶;种子培养基接种后于30℃培养24h,按10%的接种量移种至转化培养基,再加入10g/L的L-苯丙氨酸;转化体系于30℃、200r/min条件下培养18h,2-苯乙醇的浓度可达到4.64g/L,摩尔产率为62.7%,生产率为0.26g/(L·h)。采用Box-Behnken中心组合设计和响应面分析,建立了2-苯乙醇浓度与蔗糖、酵母浸出粉和L-苯丙氨酸之间的二次多项式回归模型,模型具有较高的准确性和实用性,可为生物转化法合成2-苯乙醇的最优化生产提供理论基础。采用油酸萃取,聚丙二醇2000萃取和D101大孔树脂吸附3种产物原位分离法转化合成2-苯乙醇,2-苯乙醇的摩尔产率均有所提高。在油酸与培养基体积比为1:3,振荡转速为250r/min,转化温度为30℃,底物浓度为14g/L的条件下,转化培养18h,油酸和水相中2-苯乙醇的浓度分别达到14.9g/L和1.74g/L,2-苯乙醇的摩尔产率达到64.7%,生产率达到0.37g/(L·h),较单一水相体系生物转化合成2-苯乙醇的生产率0.26g/(L·h)提高了44.3%。以聚丙二醇2000为萃取溶剂,加入体积与培养基体积比为1:2,底物浓度为12g/L时,转化18h,聚丙二醇中的2-苯乙醇浓度可达11.1g/L,摩尔产率为68.1%,生产率为0.31g/(L·h)。在30mL培养基中加入2g湿大孔树脂D101,底物浓度为12g/L,转化24h,2-苯乙醇总浓度可达6.17g/L,其中3.15g/L保留在培养基中,3.02g/L吸附到D101中,摩尔产率达到69.5%,生产率为0.26g/(L·h)。在5L发酵罐中,进行常规水相体系、有机溶剂萃取法和大孔树脂吸附法转化合成2-苯乙醇的放大实验,取得的结果与摇瓶工艺相近,表明摇瓶转化工艺放大较为容易。基于5L发酵罐生物转化合成2-苯乙醇得到的菌体得率、2-苯乙醇浓度、蔗糖消耗实验数据,建立了转化过程中菌体生长的Logistic模型、2-苯乙醇生成的Luedeking-Piret模型和蔗糖消耗的Luedeking-Piret相似模型。3个动力学模型具有较高的拟合精度,能准确反映2-苯乙醇生物转化过程及其动力学特征,可用于酿酒酵母转化生产2-苯乙醇过程的预测。通过对多种有机溶剂的筛选,得出乙酸乙酯是萃取分离2-苯乙醇的最佳溶剂,其萃取的最佳相比0.5,萃取液经减压蒸馏除去乙酸乙酯,便得到提纯的2-苯乙醇,收率为93.6%,纯度可以达到90.7%。静态吸附实验结果表明大孔树脂D101也是很好的2-苯乙醇分离吸附剂。采用大孔树脂D101柱分离2-苯乙醇中,当转化液中2-苯乙醇浓度为4.5g/L左右时,最佳上样量为5.5柱体积(BV),上样速度10BV/h。样品上柱后,用上样量同等体积的蒸馏水洗涤树脂,再用3BV的95%乙醇进行洗脱,收集洗脱液,减压蒸馏去除乙醇,此工艺条件下分离得到的2-苯乙醇样品收率为84.4%,纯度为85.2%。
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