本研究以四季桔成熟胚为外植体,建立四季桔离体再生体系,并进行长期不继代保存试管苗研究;同时,对保存各个阶段的试管苗进行叶片超薄切片及透射电镜的超微结构观察与钙分布变化研究,试图从微观的角度探讨四季桔试管苗长期保存机制。主要研究结果如下:1四季桔试管苗离体繁殖体系的建立以四季桔试管苗为材料诱导不定芽,建立了离体繁殖体系。并研究了取材部位、MS盐浓度、糖浓度、不同激素组合及其配比和光照等因素对不定芽诱导的影响。结果表明:以上胚轴为材料,形态学下端插入MS + 6-BA 1 mg·L-1 + NAA 0.1 mg·L-1培养基中,暗培养两周后再在光照下培养,不定芽诱导率最高,出芽率可达85.6%。一定时间的暗培养有助于外植体切口的愈伤组织快速形成,提高不定芽的发生率,而高浓度的6-BA和NAA对不定芽的诱导起抑制作用。不定芽增殖最佳培养基为1/2MS+ 1.0 mg·L-1 BA+0.2 mg·L-1 KT,增殖系数达到7.29。生根最佳培养基为1/2 MS+ 0.2 mg·L-1 IAA+0.5 mg·L-1 IBA,生根率为77.8%。2四季桔试管苗长期不继代离体保存研究以成熟珠心胚诱导的试管苗来保存四季桔种质资源。本试验采用在MS空白培养上保存四季桔试管苗的方法,待培养基接近完全失水时,往瓶中添加3g L-1琼脂的半液体MS空白培养基。试验结果表明,四季桔试管苗无需添加生长调节剂就能长期保存,保存最长时间已达3年。保存1年的试管苗成活率为88.9%,保存2年存活率为73.3%,保存3年时存活率为44.4%。3四季桔试管苗种质保存过程中超微结构观察以四季桔珠心胚培养的试管苗为材料,取其叶片,并按保存时间的长短分为保存一个月、保存一年、两年、三年4个阶段,对各个时期的超微结构进行观察和比较。研究结果表明:细胞衰老速度缓慢,保存前两年未见叶绿体的明显衰老特征,到第三年时才观察到部分叶绿体外膜开始向外扩张,破裂。叶肉细胞衰老速度缓慢从微观的角度为四季桔试管苗长期保存提供了证据。4四季桔试管苗种质保存过程中钙分布变化研究细胞内Ca²⁺浓度与分布区域和植物衰老有一定的相关性,通过观察细胞中Ca²⁺水平的变化可以反映出植物细胞的衰老情况。本试验按保存一个月、保存一年、两年、三年4个阶段,对各个时期叶片的钙分布变化进行观察研究。研究结果表明,随着保存时间的增加,Ca²⁺从细胞液泡中转移到细胞质、核质、细胞间隙中,细胞自身能调节Ca²⁺浓度,使其Ca²⁺浓度维持在一个较低水平,延缓其衰老。