转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)/Smad信号通路在多种组织器官发育和稳态维持过程中发挥重要的生物学功能,研究表明这个信号通路的细胞内中心介导者Smad4的异常表达会导致多种不同的发育障碍和疾病。目前对Smad4的表达调节还了解较少,已知的一些机制不足以解释Smad4在一些疾病中的表达异常,因此研究Smad4的表达调节机制对于理解Smad4表达异常在疾病发生过程中的作用具有重要的意义。微RNA(microRNA, miRNA)是内源表达并加工成熟的长度为19～25核苷酸(nucleotide,nt)的单链RNA分子,能识别靶基因mRNA的3’-非翻译区(3’-UTR)并通过抑制翻译和影响mRNA稳定性而抑制靶基因的表达。近年来的研究显示miRNA参与多种信号通路的调节并在多种生物学过程中具有广泛和重要的生理功能。我们推测,可能存在靶向Smad4基因的miRNA,它们可以通过调节Smad4基因的表达影响细胞对TGF-β信号的反应性从而具有重要的生理功能。　　本研究的目的是筛选和鉴定一批可能直接调控Smad4表达的miRNA,并对其中部分miRNA调节Smad4表达、影响细胞对TGF-β信号反应性及其在特定生物学过程中的功能进行分析和评价。为此,我们在pGL3-cm载体基础上构建了融合Smad4-3’-UTR的荧光素酶报告基因载体luc-Smad4-3’-UTR,并将 luc-Smad4-3’-UTR报告基因载体分别与miRNA表达载体共转染NIH-3T3细胞,从388种miRNA(203种miRNA表达载体由郑晓飞研究员提供)中筛选到能下调报告基因活性的miRNA共83种。将此83种miRNA表达载体分别与Smad4依赖的TGF-β响应性荧光素酶报告基因载体CAGA-lux共转染,最终筛选到39种抑制细胞TGF-β反应性的miRNA。本研究的筛选结果得到了现有主流miRNA靶基因预测软件的支持:通过与TargetScan、miRanda、Pictar、PITA等4种预测软件的结果比较发现,我们筛选出的39种可能靶向Smad4的miRNA中有24种(约62％)至少可被其中一种软件预测为靶向Smad4的miRNA。我们利用不同细胞随机验证了其中10种miRNA对Smad4基因表达的调节作用,Western结果显示过表达这些miRNA可以显著降低Smad4蛋白质的表达,提示本研究靶向Smad4的miRNA筛选是有效的和可靠的。　　为进一步研究靶向Smad4的miRNA的生物学功能,本研究选择了其中的miR-199a在细胞内进行了深入分析。NIH-3T3细胞中过表达miR-199a可抑制Smad4的表达,并且能抑制TGF-β1对CAGA-lux的诱导作用,而miR-199a-5p的反义核酸促进TGF-β1对CAGA-lux的诱导作用,提示miR-199a抑制Smad4的表达并部分阻断TGF-β1的转录激活效应。进一步,我们发现miR-199a过表达后TGF-β对内源性纤溶酶原激活物抑制因子1(plasminogen activator inhibitor Type1,PAI-1)和纤连蛋白1(fibronectin, Fn1)等TGF-β1下游靶基因的诱导作用被部分阻断,而恢复Smad4的表达能挽救miR-199a过表达的效应,提示miR-199a通过抑制Smad4的表达部分阻断了NIH-3T3细胞对TGF-β信号的反应性。此外,我们在肝细胞癌细胞系HepG2和角质细胞系HaCat等具有经典TGF-β响应性的细胞中验证了miR-199a对Smad4表达水平及其介导的细胞对TGF-β信号响应性的调节。这些结果证明miR-199a能在多种细胞中抑制Smad4的表达并部分抑制细胞对TGF-β信号的反应性。　　为研究miR-199a抑制Smad4基因表达的生物学效应,我们在3种细胞中过表达了miR-199a并观察其对TGF-β调节的细胞增殖和迁移的影响。研究结果显示HaCat细胞中miR-199a过表达能部分阻断TGF-β1诱导细胞周期阻滞的作用,这与Smad4干涉的效应类似。细胞生长曲线实验也证实miR-199a的过表达能促进HaCat和HepG2细胞的增殖并减弱TGF-β1对这些细胞增殖的抑制作用。此外,在胃癌细胞系AGS细胞中过表达miR-199a可抑制TGF-β1诱导 AGS细胞迁移的作用。这些结果显示,miR-199a过表达能减弱TGF-β抑制细胞增殖和促进细胞迁移的多种效应。　　为研究miR-199a是否直接调节Smad4的表达,我们利用生物信息学软件分析发现在 Smad4-3’-UTR的1010～1030nt位置有一个可能的miR-199a识别位点,进而在luc-Smad4-3’-UTR的基础上构建了缺失潜在识别位点的突变体。报告基因结果显示, miR-199a能抑制具有野生型Smad4-3’-UTR报告基因的活性而不能抑制具有潜在识别位点缺失突变型Smad4-3’-UTR报告基因的活性。我们利用Smad4缺失的MDA-MB-468乳腺癌细胞,外源表达野生型Smad4或缺失miR-199a潜在识别位点的突变型Smad4,同时过表达miR-199a,观察miR-199a对外源表达的Smad4的调节。结果显示miR-199a能抑制外源表达的野生型Smad4而不能抑制缺失潜在识别位点的Smad4突变体的表达。所有这些结果证明,miR-199a通过Smad4转录本3’非翻译区的识别位点直接靶向Smad4并调节Smad4蛋白质水平的表达。　　miR-199a已被报道在胃癌中表达升高,但其在胃癌细胞中的功能仍然未知。因此我们决定研究miR-199a在胃癌细胞中的功能。在SNU-16胃癌细胞中,过表达 miR-199a能抑制Smad4的表达,并抑制TGF-β1对靶基因JunB的诱导作用。同时,miR-199a过表达能部分减弱 TGF-β1对 SNU-16细胞周期阻滞和凋亡的诱导作用,而抑制miR-199a-5p则能增强细胞对 TGF-β1的敏感性。软琼脂克隆形成实验结果表明, miR-199a过表达可以促进SNU-16的克隆形成能力,并且能减弱TGF-β1对克隆形成的抑制,提示至少在体外miR-199a能促进SNU-16的成瘤能力。这些结果提示在胃癌细胞中miR-199a过表达能抑制Smad4的表达并部分抑制TGF-β1对细胞周期阻滞和凋亡的诱导作用,促进胃癌的发展。　　最后我们分析了miR-199a和Smad4在胃癌细胞系和胃癌组织中的表达。发现在5种胃癌细胞系中miR-199a和Smad4的表达呈现负相关。对10例胃癌患者标本进行表达分析,Smad4在其中7例肿瘤组织中表达下降,miR-199a则在7例肿瘤组织中表达升高。在Smad4表达下降的7例肿瘤标本中miR-199a在其中4例表达上升,这提示了miR-199a在胃癌组织中下调Smad4的可能性。　　综上所述,本研究利用Smad4-3’-UTR荧光素酶报告基因以及Smad4依赖的TGF-β响应性荧光素酶报告基因系统,从388种人类miRNA中筛选出39个可能靶向调节Smad4的miRNA。研究结果证实miR-199a能直接靶向Smad4并显著下调Smad4蛋白质水平的表达,同时减弱TGF-β1抑制细胞增殖、促进细胞迁移和诱导凋亡的多种效应,可能促进胃癌的进展。本研究丰富了对Smad4及其介导的TGF-β信号通路的新的调控层次以及调控机制的认识。筛选出的一批可能调节Smad4表达的miRNA也为进一步深入研究miRNA参与TGF-β调节生物学过程的生理功能和机制奠定了基础。