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随着世界人口进入老龄化,骨关节炎（Osteoarthritis,OA）的患病率不断上升,患病人群日益增多。OA会导致疼痛、残疾,严重影响患者的劳动能力。OA发生时,首先受到损伤的是关节软骨。关节软骨变薄、变性、破坏,软骨下骨硬化、关节间隙狭窄。对OA的治疗目前常用非甾体类抗炎药和多糖类软骨保护剂。多糖类软骨保护剂一般都是肝素类似物,如多硫酸氨基聚糖、多硫酸戊糖钠、多硫酸糖胺聚糖等。它们的作用是维持关节软骨的蛋白多糖含量,刺激软骨细胞合成Ⅱ型胶原及蛋白多糖,从而有助于维持关节软骨完整性。硫酸软骨素（Chondroitin sulfate,CS）是关节软骨的重要成分,是由重复双糖→4)-β-D-GlcUA-（1→3）-β-D-GalNAc-(1→构成的糖胺聚糖。OA发生时,软骨受到损害,CS含量下降。补充CS能有效缓解症状,减轻炎症区域的肿胀度、下调基质金属蛋白酶-9,减轻OA对软骨的损害;还可能降低发病率、关节温度、痛感。临床上已有CS的复方口服药物或膳食补充剂,用于骨关节炎患者的治疗和保健。而深入研究发现,CS由于糖链上硫酸基位置的不同具有多种异构体。目前使用的CS药物多从动物软骨组织提取,其成分多是4-硫酸软骨素（CSA）和6-硫酸软骨素（CSC）。而在人关节软骨中主要含有的是4,6-二硫酸软骨素（CSE）。体外实验发现,当模拟OA发生时,培养的软骨组织中4,6-双硫酸软骨素含量下降,而有针对性的补充4,6-双硫酸软骨素在低浓度即可刺激软骨基质合成,并抑制蛋白酶合成,具有显著的软骨保护效应。提示硫酸根和其负电荷可能对OA的发病和治疗都非常重要。为开发针对OA发病机制的特异性的软骨保护剂,本课题采用氯磺酸-甲酰胺磺化法对4-硫酸软骨素进行多硫酸化衍生,制备了含有4,6-双硫酸软骨素结构的多硫酸化硫酸软骨素（Polysulfated chondroitin sulfate,PSCS）,使硫酸软骨素带上更多的负电荷,改变了其构象。由于PSCS是带有大量负电荷的大分子,口服不易吸收,要开发成口服治疗OA的药物,需要制备成带负电荷少、容易吸收的口服制剂。因此我们研究了PSCS的制备、鉴定、剂型及对兔膝OA的药理活性。1 PSCS的制备、纯化及性质用氯磺酸-甲酰胺磺化法对CS进行多硫酸化,制备PSCS。通过SO42-含量测定和SO42-/COO-比值测定验证磺化结果,SO42-含量从12.76%上升到20.62%,增加了7.76%;SO42-/COO-比值从1.35上升到3.35。产率达78.9%。对产物PSCS进行毛细管电泳分析和高效液相色谱分析,均只出现一个对称尖峰,证明所得产品较纯。并测定了其理化性质,包括糖醛酸含量、氨基己糖含量、绝对分子量、比旋度等。同时测定了PSCS的抗凝效价为40usp/mg。说明PSCS具有一定的抗凝活性。2 PSCS的结构研究用UV、IR、1H-NMR和13C-NMR分析了PSCS的结构。UV显示,样品不含共轭双键,也不含有蛋白质和核酸等杂质。经与CS红外光谱对比,证实了PSCS具有CS基本母链结构,即含有葡萄糖醛酸与半乳糖胺双糖单位,吡喃糖为β构型。并且在PSCS的IR上出现了硫酸基加在了半乳糖胺6位碳上的特征吸收峰818cm-1,可以判断半乳糖胺6位碳上羟基被硫酸基取代。经过1H-NMR和13C-NMR进一步解析,葡萄糖醛酸的C-2、C-3位都连接上了硫酸基。PSCS主要双糖结构应该为由2,3位硫酸化的葡萄糖醛酸和4,6位O硫酸化的半乳糖胺组成→4)-β-D-GlcUA（2S,3S）-（1→3）-β-D-GalNAc（4S,6S）-(1→。3 PSCS口服制剂的制备筛选了PSCS-壳聚糖纳米粒剂型的制备条件和方法。其优化条件为:壳聚糖的分子量为5kDa,其浓度为2mg╱ml,溶液的pH6.0,加入的PSCS浓度为1mg/ml,体积为壳聚糖溶液的四分之一,滴加速度为2秒/滴,滴加时壳聚糖反应液涡旋转速为600r/min。所得PSCS-壳聚糖纳米粒径在200nm左右,所带电荷为+46mV左右。具有较好的均一性、圆整度和稳定性。4 PSCS对兔膝骨关节炎的软骨保护作用用兔膝关节腔内注射Ⅱ型胶原酶建立了骨关节炎早期模型。每日灌胃给PSCS-壳聚糖纳米粒,持续4w。行为学、影像学、病理学检测证实了口服PSCS-壳聚糖纳米粒对兔膝骨关节炎具有一定的疗效。行为学观察可见口服给药PSCS,对骨关节炎的膝疼痛有一定缓解作用。X光片显示,模型组关节面粗糙,关节间隙变窄,有疑似骨赘。而用药组关节面较光滑,关节间隙只是略有变窄,无骨赘。剥离软骨,观察软骨表面:用药组关节软骨表面与模型组相比,软化灶更少,光泽度更好。观察软骨HE染色病理切片,显示PSCS用药组能有效保护软骨表面完整性和深层细胞及结构;经Markin评分,结果显示,模型组为5.76±3.23,PSCS低剂量组为3.98±1.88,PSCS高剂量组为3.32±2.02。PSCS高、低剂量组与模型组相比都具有统计学差异,说明低剂量PSCS即具有一定的缓解软骨退行性变的作用。可以认为PSCS具有一定的软骨保护功能。检测了兔血清中TNF-α和IL-1β的含量。PSCS低剂量组TNF-α含量为8.98±1.98pg/ml,与模型组18.76±1.23pg/ml相比具有显著性差异,说明PSCS能有效抑制骨关节炎模型兔血清中TNF-α的增高,且与阳性药物组9.92±1.16pg/ml的效果无统计学差异。IL-1β的含量PSCS组与模型组对比无显著性差异。本课题取得的主要成果:■成功的制备了纯度较高的多硫酸化硫酸软骨素PSCS,并确认了它含有4,6-双硫酸软骨素结构。■成功的制备了PSCS-壳聚糖纳米粒,并筛选了PSCS-壳聚糖纳米粒制备的最优条件。■将PSCS-壳聚糖纳米粒用于兔膝骨关节炎治疗,证实了PSCS对早期OA具有明显的软骨保护作用。同时也验证了PSCS-壳聚糖纳米粒被机体有效吸收。