AGEs/RAGE轴通过P38MAPK/JNK信号通路促进人主动脉平滑肌细胞凋亡

来源 :四川医科大学 西南医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:yp7611
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目的:血管平滑肌细胞的凋亡在血管钙化中的作用受到越来越多的重视。研究表明,在动脉粥样硬化斑块中凋亡的血管平滑肌细胞明显增多;在慢性肾病患者体内由于钙磷代谢紊乱,产生的大量磷酸钙晶体被血管平滑肌细胞吞噬,再通过细胞溶酶体作用而被降解,引起细胞内钙、磷水平急剧升高,导致细胞凋亡,继而形成凋亡小体,这些凋亡小体可作为血管基质矿化的核点启动钙化过程。晚期糖基化终末产物(advanced gly cation end products,AGEs)是一组由体内糖的醛基与蛋白质的氨基相互作用生成的一种带电荷的氨基酸残基,生理状态下机体内AGEs表达很低。生物体内AGEs通过与相应受体相结合后发挥生物学作用,目前研究最多的受体为RAGE(receptor for advanced glycation end product s)。本研究拟探究AGEs在人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)凋亡中的作用、是否通过AGEs-RAGE(配体-受体结合方式)来发挥生物学效应以及相关信号通路的分子机制。方法:原代培养人主动脉平滑肌细胞,取第3-5代细胞进行试验。用不同浓度AGEs-BSA(50mg/L、100mg/L、200mg/L)刺激细胞48h后,流式细胞仪检测HASMCs的凋亡,Western blot检测细胞中促凋亡相关蛋白p53、BAX、Caspase3,抗凋亡相关蛋白p65、Cox-2、Bcl2以及RAGE蛋白表达情况。为确定RAGE在AGEs促细胞凋亡中的作用,分别构建人过表达和沉默RAGE基因的慢病毒载体,分别将其转染至HASMCs,Western blot和q-PCR检测成功达到不同RAGE蛋白表达效率的HASMCs后,予以A GEs-BSA刺激,流式细胞仪检测表达不同水平RAGE蛋白的HASMCs的凋亡,Western blot检测相应细胞中促凋亡相关蛋白p53、BAX、Caspase3,抗凋亡相关蛋白p65、Cox-2、Bcl2的表达情况。为明确p38 MAPK、JNK途径是否参与细胞凋亡过程,给予AGEs-BSA刺激细胞不同时间(6h、12h、24h、48h)后,Western blot检测HASMCs的JNK和p38 MAPK磷酸化产物的活化情况;为继续验证p38 MAPK、JNK途径的作用,分别引入JNK抑制剂sp600125和p38 MAPK抑制剂SB203580干预细胞,再次运用流式细胞仪检测HASMCs的凋亡,Western blot检测细胞caspase3蛋白表达情况。结果:成功培养人主动脉平滑肌细胞,分别予以不同浓度(50mg/L、100mg/L、200mg/L)AGEs-BSA刺激48h后,细胞凋亡呈浓度依赖性增加,凋亡率分别为8.43%、12.49%、24.90%;HASMC中促凋亡相关蛋白p53、BAX、Caspase3表达呈浓度依赖性增加,抗凋亡相关蛋白p65、Cox-2、Bcl2表达呈浓度依赖性降低;HASMCs中RAGE蛋白表达呈浓度依赖性增加。构建过表达/沉默RAGE基因的HASMCs稳定细胞株,各株细胞绿荧光蛋白成功表达;RAGE基因过表达细胞中RAGE蛋白表达水平明显高于对照组(0.97±0.02vs0.44±0.01,p<0.01);RAGE基因过表达细胞中RAGE m RNA水平明显高于对照组(1588.55vs1.26);RAGE基因沉默细胞中(RAGE-sh RNA-3沉默细胞后细胞活性明显受到抑制,在转染24h内基本死亡)RAGE蛋白表达水平明显低于对照组(0.56±0.02,0.86±0.01vs1.25±0.02,p<0.01);RAGE基因沉默细胞中RAGE m RNA水平较对照组受到显著干扰,RAGE-sh RNA-2组干扰率为99.55%;RAGE-sh RNA-3组干扰率为98.86%。RAGE-c DNA组细胞凋亡率较对照组明显升高(33.69%vs17.52%),RAGE-sh RNA-3组细胞凋亡率较对照组明显降低(8.41%vs17.52%)。RAGE-c DNA组细胞中促凋亡蛋白p53、BAX、caspase3的表达较对照组显著增加(0.84±0.01vs0.44±0.01,1.64±0.01vs0.72±0.02,0.83±0.02vs0.53±0.01),而RAGE-sh RNA-3组细胞中抗凋亡蛋白p65、cox-2、Bcl2的表达较对照组明显降低(0.14±0.01vs0.44±0.01,0.15±0.01vs0.72±0.02,0.31±0.01vs0.53±0.01)。对HASMCs给予200mg/L AGEs-BSA刺激,分别于刺激6h、12h、24h、48h等时间点,检测JNK和p-JNK、p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白的表达,发现在予以AGEs-BSA刺激后p-JNK表达逐渐增高,在12h时达到最高峰,然后逐渐下降,p-p38 MAPK表达亦逐渐增高,在48h时达到最高峰,而总的JNK和p38 MAPK均没有明显的变化。为验证P38 MAPK和JNK通路在细胞凋亡中的作用,JNK抑制剂SP600125和p38 MAPK抑制剂SB203680被应用于实验,SP600125、SB203680分别干预细胞24小时后,HASMCs的caspase3蛋白表达均明显受到抑制;同时在P600125、SB230580预处理后,AGE-BSA诱导的HASMC的凋亡率显著降低(6.25%vs18.49%、6.15%vs 18.49%)。结论:1、AGEs能促进人主动脉平滑肌细胞凋亡;2、RAGE在AGEs促进人主动脉平滑肌细胞凋亡的过程中起着至关重要的作用;3、AGEs/RAGE轴通过p38 MAPK/JNK信号途径从而促进人主动脉平滑肌细胞凋亡。
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