论文部分内容阅读
第一部分IP10-EGFRvIIIscFv融合蛋白的构建和制备目的通过基因工程技术构建细胞因子融合蛋白IP10-EGFRvIIIscFv,并完成融合蛋白的大量扩增、纯化与复性。方法基因工程技术构建真核重组表达质粒GV219IP10-EGFRvIIIscFv,两段目的基因依次克隆于重组质粒GV219Pcmv启动子的下游,二者以编码(Gly4Ser)3的柔性接头序列(linker)相连。利用限制性核酸内切酶将目的基因IP10-scFv从真核表达载体上酶切下来,加入到高效原核表达载体PET3Oa的T7启动子下游,在IPTG的诱导下高效表达融合蛋白,通过His6-tag标签镍磁珠纯化蛋白后进行透析复性。并在透析缓冲液中加入GSSG/GSH氧化还原体系,促进变性融合蛋白的复性。以银染检测融合蛋白的纯度,western-blotting分析融合蛋白。结果成功构建了真核重组表达质粒GV219IP10-EGFRvIIIscFv,通过PET高效原核表达系统,获得大量的融合蛋白(包涵体表达),镍磁珠连续分选获得纯度>95%的融合蛋白,银染和western-blotting检测融合蛋白的分子量为46kDa。第二部分Angiopep-2、IP10-EGFRvIIIscFv融合蛋白表面修饰纳米颗粒的制备及脑穿越实验目的通过纳米技术制备Angiopep-2、IP10-EGFRvIIIscFv表面修饰纳米颗粒,并完成纳米颗粒穿越血脑屏障的体内、体外研究。方法使用生物纳米材料聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA)和PLGA-PEG-Mal制备高分子多聚体纳米颗粒,同时以Angiopep-2和/或IP10-scFv修饰纳米粒表面,分别制备出实验组AINPs、对照组ANPAs、INPs和NPs。以香豆素-6和若丹明B(RhoB)作为荧光探针,对AINPs的脑内递药特性进行体外评价。以香豆素-6标记的荧光纳米粒,经尾静脉注射BABL/C/Nude nu,通过激光共聚焦检测对AINPs的脑内递药特性进行体外评价。以DiR作为荧光探针标记纳米颗粒,尾静脉注射BABL/C/Nude nu,利用活体成像手段实现对AINPs的脑内递药特性的体外评价。结果我们制备出的AINPs透射电镜下可见外观圆整,大小均一,平均粒径为143.6±0.7nm, Zeta电位为-25.61±3.53mV,体外实验中,End.3细胞株和原代大鼠脑毛细血管内皮细胞(BCECs)能有效摄取AINPs。体内实现中,AINPs能显著穿越BABL/C/Nude nu进入脑实质内。通过体内体外实验,说明我们制备的AINPs能有效的透过血脑屏障。第三部分Angiopep-2, IP1O-EGFRvIIIscFv融合蛋白修饰纳米粒联合CTL的抗脑恶性胶质瘤功能研究目的评价AINPs体外趋化特性和靶向胶质瘤细胞特性,以及联合CTL治疗脑胶质瘤实验。方法Transwell趋化实验检测AINPs的趋化特性,利用免疫荧光染色检测AINPs抗原抗体结合实验,体外诱导胶质瘤抗原特异性DC细胞,并与CD8+T淋巴细胞混合培养,制备出胶质瘤特异性的细胞毒T淋巴细胞CTL,并联合AINPs经尾静脉注射BABL/C/Nude nu原位脑胶质瘤模型,观察荷瘤小鼠的生存时间及肿瘤体积的大小变化。结果AINPs能有效趋化CD8+T淋巴细胞,也能有效的与U87-EGFRvIII细胞株的特异抗原EGFRvIII特异结合。通过DC混合培养技术成功制备出胶质瘤特异性的细胞毒T淋巴细胞CTL,在AINPs的趋化作用下,富集在肿瘤组织周围,实现对胶质瘤细胞的有效杀伤作用。