论文部分内容阅读
本研究通过体内外试验,旨在探讨未发酵玉屏风多糖(UYP)和少孢根霉菌SH发酵的玉屏风多糖合生元(FYP)的单糖构成、免疫活性及其对獭兔肠道菌群和屏障的影响。将不同浓度的UYP或FYP同正常或经脂多糖(LPS)诱导的小鼠免疫细胞孵育,探究其体外免疫活性；选取45只断奶獭兔,预饲一周后随机分为对照组(NC)、UYP组和FYP组,分别饲喂含1%o生理盐水、UYP和FYP的基础日粮,持续28 d,探究体内免疫活性和对獭兔肠道菌群及屏障的影响。结果如下：1. GC-MS测得UYP和FYP的单糖主要是果糖和吡喃葡萄糖苷,FYP中毗喃葡萄糖苷较UYP显著提高(P<0.01)。2.MTT试验表明,UYP、FYP和LPS均显著促进小鼠免疫细胞增殖(P<0.01),但前两者的活性均显著低于LPS(P<0.01)：FYP对巨噬细胞增殖的影响显著强于UYP(P<0.01),部分浓度的FYP对淋巴细胞增殖的影响也显著强于UYP(P<0.05或P<0.01);此外,UYP和FYP均显著降低经LPS诱导的小鼠淋巴细胞的增殖活性(P<0.01),分别在3.200 mg/mL和0.200 mg/mL时脾脏淋巴细胞增殖活性与正常细胞差异不显著(P>0.05),且均在0.800 mg/mL时胸腺淋巴细胞增殖活性与正常细胞差异不显著(P>0.05),但FYP处理后更接近正常胸腺淋巴细胞增殖活性。3.中性红试验表明,UYP和FYP均显著提高小鼠巨噬细胞的吞噬能力和合成NO能力(P<0.01)。FYP较UYP显著增强其吞噬活性(P<0.01),在0.050 mg/mL及以上浓度时显著促进其释放NO(P<0.01),但均显著低于LPS的作用(P<0.01)。4.rtPCR分析UYP和FYP体外对小鼠免疫细胞基因表达的影响,结果表明,LPS显著上调炎性细胞因子、TLR4、NF-κB和iNOS的表达(P<0.01),UYP显著上调脾淋巴细胞TLR4和NF-κB的表达(P<0.05),FYP显著上调巨噬细胞iNOS、脾淋巴细胞TLR4(P<0.01)和淋巴细胞NF-r,B的表达(P<0.05),且FYP活性高于UYP,但显著低于LPS(P<0.01)。此外,UYP和FYP显著抑制经LPS诱导的炎性细胞因子、TLR4、NF-κB (P<0.01)和iNOS (P<0.05)的表达；FYP较UYP显著降低巨噬细胞TLR4、NF-κB和胸腺淋巴细胞TLR4的表达(P<0.01)。5.獭兔体内试验表明,UYP(P<0.05)和FYP(P<0.01)均显著提高獭兔平均日增重,FYP的活性显著高于UYP(P<0.01)；且两者均显著提高其脾脏指数(P<0.01),FYP的活性显著高于UYP(P<0.05)。6.rtPCR分析表明,UYP和FYP均能促进獭兔脾脏中细胞因子的表达,FYP更有效的上调IL-2、TNF-α和IL-10的mRNA水平(P<0.05)。ELISA检测表明,UYP和FYP均提高獭兔血清中IL-2、IL-4、IL-12、TNF-α和IFN-γ的蛋白浓度,FYP较UYP更有效的上调血清中细胞因子的蛋白浓度,其中IL-2、IL-6、TNF-α和IL-10显著提高(P<0.05或P<0.01)。7. rtPCR分析表明,UYP显著上调獭兔空肠(P<0.05)、回肠和脾脏(P<0.01)中TLR2及回肠、盲肠和脾脏(P<0.01)中TLR4的表达,FYP显著促进空肠、回肠和脾脏中TLR2及空肠、回肠、盲肠和脾脏中TLR4的表达(P<0.01)；FYP较UYP显著增加空肠(P<0.05)和回肠(P<0.01)中TLR2及空肠(P<0.05)和脾脏(P<0.01)中TLR4的表达。8. PCR-DGGE分析獭兔肠道菌群结构表明,空肠和回肠中UYP组和FYP组间DGGE图谱相似性较高；聚类图显示,空肠和回肠中的UYP组和FYP组聚为一簇；PCA图显示,PCAl将空肠和回肠的UYP组和FYP组与NC组分开；空肠和回肠中UYP组和FYP组的菌群多样性均显著高于NC组(P<0.05或P<0.01);FYP较UYP更能提高空肠(P<0.05)和回肠的菌群多样性。9. rtPCR分析獭兔肠道菌群丰度表明,UYP和FYP显著提高空肠和回肠总菌、拟杆菌门、厚壁菌门、普雷沃氏菌属、丁酸弧菌和梭菌类型Ⅳ、XIVa(P<0.01)和空肠中乳酸菌属的丰度(P<0.05),降低空肠和回肠肠球菌属(P<0.01或P<0.05)和回肠中链球菌属的丰度(P<0.01)；FYP较UYP显著提高回肠中总菌、厚壁菌门、丁酸弧菌(P<0.01)和空肠中产琥珀酸丝状杆菌的丰度(P<0.05),降低回肠中肠杆菌科、肠球菌属和空肠中肠球菌属的丰度(P<0.01)。10.rtPCR分析獭兔肠道屏障基因表明,FYP显著上调空肠中p-防御素、EGF(P<0.05)、TFF(P<0.01)和回肠中ZO-1、封闭蛋白、p-防御素、TFF(P<0.05)、PIGR和EGF(P<0.01)的表达；FYP较UYP显著提高空肠中EGF(P<0.05)和回肠中ZO-1、封闭蛋白(P<0.05)、PIGR和EGF(P<0.01)的表达。综上所述,UYP和FYP具有双向体外免疫活性,并可增强獭兔的免疫、改善其空肠和回肠菌群结构及屏障功能,且FYP的效果强于UYP。