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在妊娠早期,母畜外周血浆中的孕酮含量远远高于发情期,所以可以通过测定血液中的孕酮含量来进行早期妊娠诊断。传统的测定方法主要有放射免疫测定法(RIA),酶免疫测定法(EIA)和乳胶凝集测定试验(LAIT),但是由于操作比较复杂,所以并未得到广泛的应用。胶体金免疫层析技术是20世纪90年代在免疫渗滤技术基础上建立的一种简易快速的免疫检测技术,其检测结果通过肉眼即可判断。这种技术具有操作简便,操作时间短等优点,已经广泛地应用于食品安全和激素的检测。本试验采用胶体金免疫层析技术,根据试验确立的湖羊妊娠孕酮临界值,应用竞争法研制出一种胶体金免疫层析试纸条；通过对配种后21d左右湖羊血液中的孕酮进行半定量测定,进行早期妊娠诊断,具有很好的应用价值。试验的主要内容包括以下3个部分：1.对85头配种后21 d左右未出现返情的湖羊采用放射免疫测定法(RIA)测定其外周血中的孕酮含量。研究结果表明,妊娠羊的孕酮含量为2.33±0.70ng/mL,未妊娠羊的孕酮含量为1.24±0.33ng/mL,怀孕羊的孕酮水平高于未怀孕羊,且差异显著(P<0.05)。设定孕酮含量大于1.7ng/mL为妊娠,低于1.5ng/mL为未妊娠,介于两者之间为疑似怀孕。根据上述标准,妊娠确诊率为100%,未妊娠确诊率为82.61%,疑似妊娠确诊率为64%。2.为了获得高质量的金标孕酮单抗,通过采用柠檬酸三钠还原法制备出符合要求的30 nm的胶体金溶液,在此基础上摸索胶体金标记孕酮单克隆抗体的最佳条件,并对其进行质量鉴定。用柠檬酸三钠还原法制备的30 nm胶体金溶液呈深红色,透射电镜观察,胶体金颗粒大小基本一致；胶体金标记孕酮单克隆抗体的最低稳定浓度为16μg/mL,最适稳定浓度为19.2μg/mL,最适标记pH为8.5。经电镜观察,制备的金标抗体复合物周围有一层明显的低电子密度晕圈,且其在520 nm处的OD值在0.2～0.4范围内。3.利用胶体金免疫层析技术竞争法原理,根据试验所得的湖羊早孕诊断血液孕酮临界值,用金标孕酮单抗复合物为探针制成金标垫,同时用11α-羟孕酮琥珀酸酯与BSA的偶联物和羊抗小鼠IgG二抗包被硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线,制备了半定量检测孕酮的胶体金免疫层析试纸条。结果采用国产SB-08玻璃纤维膜作为样品垫材料,进口Ahlstrom8964玻璃纤维膜作为金标垫,Millipore135硝酸纤维素(NC)膜作为层析材料制成试纸条。检测线和质控线上的包被浓度分别为1.6mg/mL和1.2mg/mL,金标孕酮单抗按1:2稀释后浸金法制作金标垫。NC膜划线后用3%BSA的封闭液进行封闭。试纸条的特异性、稳定性及重复性良好。临床检测27头湖羊,结果显示,与RIA法的符合率为77.8%,与生产记录进行对比后发现,用试纸条进行诊断的妊娠准确率为83.3%,未妊娠准确率为66.7%。