研究背景宫颈癌的发病率和死亡率在全球女性癌症中均排第四位。顺铂是宫颈癌新辅助化疗、同步放化疗以及晚期全身治疗的首选化疗药物。尽管新辅助化疗的临床意义目前还存在很大的争议,但仍有许多局部晚期的宫颈癌患者通过顺铂新辅助化疗获得了根治性手术的机会,而顺铂耐受的患者往往无法从此获益;对于同步放化疗,顺铂除了本身对宫颈癌细胞的杀伤作用以外,也对放射治疗起增敏作用,所以宫颈癌患者对顺铂的反应直接影响同步放化疗的疗效;而对于伴有复发转移的晚期宫颈癌患者,往往预后较差,生存期较短,顺铂耐受的患者预后则会更差。因此找到影响宫颈癌顺铂敏感性的关键分子可能有助于对治疗疗效的预测,更好地调整治疗方案,同时可能有助于顺铂增敏剂或联合治疗药物的开发,增强顺铂在宫颈癌治疗中的疗效。近年来,测序及生物信息学技术的应用给肿瘤发生发展及药物敏感性方面的研究带来了极大便利。其中第二代测序技术成本较低,且灵敏度较高,可通过对数以百万计不同DNA片段混合物进行深度测序,从而在短时间内获得与个体或疾病相关的全部基因组信息。第二代测序技术已经广泛应用于包括宫颈癌在内的泛癌领域研究中,用于识别高效、安全、特异的分子靶点,以揭示特定的耐药分子机制,为肿瘤患者提供有效的个体化治疗方案。研究目的基于第二代测序技术和生物信息学方法,并结合细胞及动物实验,阐明与宫颈癌细胞顺铂敏感性相关的核心基因BRCA1在调控顺铂敏感性中的作用以及可能的机制,为提高宫颈癌细胞对顺铂的敏感性提供新的理论依据和方向。方法1.宫颈癌顺铂耐药相关基因的筛选及分析验证(1)通过第二代测序技术对宫颈癌顺铂耐药细胞SiHa/DDP和正常宫颈癌细胞SiHa进行转录本测序,并进行差异基因表达及富集分析。利用获得的顺铂耐药相关差异表达基因构建蛋白互作网络,通过Cytoscape软件中的cytoHubba插件筛选核心基因。(2)筛选GEO数据库宫颈癌组织芯片,通过ROC曲线及箱式图对核心基因在宫颈癌顺铂耐药患者组织中的表达情况进行验证,通过qPCR技术和Western Blot技术在宫颈癌顺铂耐药细胞中进行进一步验证。2.BRCA1在宫颈癌顺铂敏感性中的调控作用研究(1)分别将BRCA1过表达质粒(OV-BRCA1)、敲减质粒(shBRCA1)通过脂质体转染技术转染进入细胞,构建BRCA1低表达(shBRCA1-SiHa)和过表达(OV-BRCA1-SiHa)SiHa细胞模型以及BRCA1低表达(shBRCA1-SiHa/DDP)Si Ha/DDP细胞模型,通过MTS方法检测BRCA1对宫颈癌细胞顺铂敏感性的影响。(2)通过流式细胞凋亡检测、Hoechst染色以及Western Blot技术检测抑制BRCA1表达对顺铂作用下SiHa/DDP和SiHa细胞凋亡的影响。(3)分别将BRCA1低表达(shBRCA1-SiHa/DDP)及阴性对照(NCSi Ha/DDP)SiHa/DDP细胞注射入小鼠皮下,构建宫颈癌皮下移植瘤模型,定期给予顺铂治疗,观察荷瘤小鼠的肿瘤体积变化。3.抑制BRCA1在增强宫颈癌顺铂敏感性的机制探究(1)通过第二代测序技术对shBRCA1-SiHa/DDP及NC-Si Ha/DDP细胞进行转录本测序,并对测序结果进行富集分析,探究BRCA1调节宫颈癌顺铂敏感性的可能下游通路。(2)应用线粒体特异性还原剂Mito Tempo通过MTS法检测抑制ROS后宫颈癌细胞活力变化。(3)应用NF-κB通路抑制剂通过MTS法和流式细胞术检测抑制NF-κB通路在顺铂诱导Si Ha/DDP细胞凋亡中的作用及ROS含量的变化。(4)Western Blot技术检测shBRCA1-SiHa/DDP与NC-SiHa/DDP细胞以及Si Ha/DDP与SiHa细胞中NF-κB p65以及IκBα蛋白表达情况。(5)制备宫颈癌小鼠移植瘤石蜡包块,应用HE染色观察肿瘤组织形态学变化,应用免疫组化染色检测两组肿瘤组织BRCA1、NF-κB p65以及IκBα表达情况。结果1.宫颈癌顺铂耐药相关基因的筛选及分析验证(1)宫颈癌顺铂耐药细胞株SiHa/DDP的形态学观察及耐药指数测定光镜下观察显示诱导耐药后的Si Ha/DDP细胞多为梭形,更加细长,可见双核细胞,细胞间黏附消失,明显的胞内空白样。IC50结果显示Si Ha/DDP对顺铂产生明显的耐药性,耐药指数为5.57倍(>5倍)。(2)筛选宫颈癌顺铂耐药相关差异基因,发现BRCA1与宫颈癌顺铂敏感性密切相关。通过第二代测序技术对Si Ha/DDP和Si Ha细胞进行转录本测序,共获得526个宫颈癌顺铂耐药相关差异表达基因,包括389个上调基因和137个下调基因。并以此为基础构建了蛋白互作网络,筛选出包括MYC、CDH1、CXCL10、OASL、BRCA1、CD274、CXCL11、HIST1H2AD、HLA-DRA、IFIT1在内的10个degree最高的差异基因作为核心基因。通过对GEO数据库组织芯片GES56363中宫颈癌顺铂耐药患者表达谱进行分析,发现10个核心基因中只有BRCA1在宫颈癌顺铂耐药患者中显著高表达,并具有较高的诊断价值(AUC>0.9)。q PCR和Western Blot结果显示,SiHa/DDP中BRCA1的m RNA及蛋白水平均显著高于SiHa细胞。2.BRCA1在宫颈癌顺铂敏感性中的调控作用研究(1)成功构建BRCA1低表达和过表达细胞稳转模型,证实BRCA1对宫颈癌顺铂敏感性的调控作用qPCR及Western blot结果显示,BRCA1低表达(shBRCA1-SiHa)和过表达Si Ha(OV-BRCA1-SiHa)以及BRCA1低表达Si Ha/DDP(shBRCA1-Si Ha/DDP)稳转模型构建成功。MTS结果显示BRCA1低表达组细胞对顺铂敏感性显著高于阴性对照组,而BRCA1过表达组细胞对顺铂敏感性显著低于阴性对照组。(2)抑制BRCA1可以促进顺铂诱导的宫颈癌细胞凋亡通过流式细胞凋亡检测发现,BRCA1低表达组细胞在顺铂作用下细胞凋亡率显著高于阴性对照组。Hoechst染色发现,SiHa及SiHa/DDP细胞在顺铂作用下可见显著的核碎裂及染色质凝聚,而且无论是SiHa还是Si Ha/DDP细胞,shBRCA1组细胞凋亡的程度均高于阴性NC组。Western Blot结果显示,相较于对照组,shBRCA1-SiHa/DDP细胞中裂解的Caspase 3和Bax的表达量增加,而Bcl-2的表达量降低。(3)体内实验检测抑制BRCA1表达对宫颈癌顺铂敏感性的影响顺铂对BRCA1下调移植瘤小鼠(shBRCA1)的抑瘤作用明显优于对照组(NC),表明BRCA1低表达裸鼠对顺铂敏感性升高。3.抑制BRCA1在增强宫颈癌顺铂敏感性的机制探究(1)shBRCA1-SiHa/DDP与NC-SiHa/DDP稳转细胞差异表达基因的筛选及富集分析对shBRCA1-SiHa/DDP和NC-SiHa/DDP细胞进行转录本测序,共找到869个差异表达基因,包括254个上调基因和615个下调基因。KEGG通路富集结果显示,差异基因主要富集在NF-κB信号通路、TNF信号通路、JAK-STAT信号通路、PI3K-Akt信号通路等与耐药相关的通路上,其中NF-κB信号通路富集程度较为显著。(2)抑制NF-κB通路可以上调细胞内ROS水平,增强顺铂诱导的SiHa/DDP细胞凋亡MTS结果显示,加入Mito Tempo的SiHa/DDP细胞组在顺铂诱导24h后存活率明显高于对照组,NF-κB抑制剂与顺铂联用组Si Ha/DDP细胞在顺铂诱导24h后存活率明显低于对照组。流式结果显示,NF-κB抑制剂能显著上调Si Ha/DDP细胞内ROS的含量。Western blot提示加入NF-κB抑制剂的Si Ha/DDP细胞组在顺铂作用后相较于对照组裂解的Caspase 3和Bax的表达量增加,而Bcl-2的表达量降低。(3)抑制BRCA1表达可能通过介导NF-κB通路抑制增强宫颈癌细胞顺铂敏感性Western Blot结果显示,与对照组相比,shBRCA1-Si Ha/DDP细胞中细胞核中NF-κB p65蛋白表达显著降低,细胞质中NF-κB p65蛋白表达显著升高,IκBα蛋白表达显著升高。同时,SiHa/DDP细胞细胞核中NF-κB p65蛋白表达量高于Si Ha细胞,细胞中IκBα蛋白表达量低于SiHa细胞。(4)体内实验检测抑制BRCA1表达对NF-κB通路影响免疫组化染色结果显示,shBRCA1-Si Ha/DDP组宫颈癌裸鼠移植瘤NF-κB p65免疫组化染色阳性信号低于阴性对照组,IκBα阳性信号高于阴性对照组。结论1.基于第二代测序技术和生物信息学方法发现BRCA1是宫颈癌顺铂耐药调控网络中的核心分子,并在宫颈癌顺铂耐药组织及细胞中上调表达。2.BRCA1的下调表达与宫颈癌顺铂敏感性的增加密切相关。3.抑制BRCA1表达可能通过抑制NF-κB通路激活,促进顺铂诱导的细胞ROS的累积,从而增强宫颈癌顺铂敏感性。