【摘 要】
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目的:构建重组融合蛋白p Smart1-CRIg-CD59原核表达载体,并通过大肠杆菌表达系统对其进行表达和纯化。纯化后的融合蛋白CRIg-CD59蛋白通过CD59强大的补体免疫抑制效应和CRIg的补体靶向活性,最终得到一种具有局部补体靶向活性的高效补体免疫抑制剂,在大鼠佐剂诱导性关节炎模型中发挥生物学活性,缓解甚至逆转疾病的进展。方法:从人肝脏细胞HHMa中提取总RNA,采用逆转录—聚合酶链反应
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目的:构建重组融合蛋白p Smart1-CRIg-CD59原核表达载体,并通过大肠杆菌表达系统对其进行表达和纯化。纯化后的融合蛋白CRIg-CD59蛋白通过CD59强大的补体免疫抑制效应和CRIg的补体靶向活性,最终得到一种具有局部补体靶向活性的高效补体免疫抑制剂,在大鼠佐剂诱导性关节炎模型中发挥生物学活性,缓解甚至逆转疾病的进展。方法:从人肝脏细胞HHMa中提取总RNA,采用逆转录—聚合酶链反应（RT-PCR）和DNA无缝克隆（Seamless Cloning）技术,将编码人CRIg胞外IgV段基因序列克隆至p Smart-Ⅰ载体上,获得p SmartⅠ-CRIg;用同样的方法将人肺癌细胞系A549中将克隆人CD59胞外功能段序列克隆至p SmartⅠ-CRIg体载上,并在CD59的5’端引物设计时加入（Ser Gly4）3柔性linker序列,获得p SmartⅠ-CRIg-CD59原核表达质粒。选择阳性菌落质粒进行测序验证序列后,通过原核表达体系表达和纯化CRIg-CD59蛋白,并用SDS-Page及Western Blot对产物进行验证。体外进行补体经典途径及旁路途径溶血活性实验验证结构域活性,表面等离子共振（surface plasmon resonance）检测蛋白与C3b及i C3b结合力。建立大鼠的佐剂诱导性关节炎模型（各模型分组:AIA模型组,PBS治疗组,地塞米松治疗组,CRIg-CD59治疗组）,定期对大鼠的足爪体积、肿胀情况等进行观察评价各组的临床评分及行为学评分;Elisa法检测组织局部与血清炎症及趋化因子水平,拍摄显微螺旋CT（Micro-CT）观察关节侵蚀破坏,取骨关节样本行4%多聚甲醛固定及EDTA2+脱钙后制作关节切片,HE染色及番红O-固绿染色观测软骨破坏及滑膜增生情况。结果:从人肝脏细胞HHMa中克隆出的CRIg胞外IgV结构域序列片段大小为795bp,从人肺癌细胞系A549中克隆出的CD59胞外功能段序列长度231bp,最终克隆至p SmartⅠ上的CRIg-（Ser Gly4）3-CD59序列长度为1071 bp,测序结果显示无突变。原核表达及纯化后的目的蛋白分子量大小为52.1 kd。体外经典途径及旁路途径溶血实验显示CRIg-CD59在36μM处可达最大补体抑制活性;表面等离子共振检测显示CRIg-CD59与C3裂解产物有着较小的平衡解离常数（KD）,表观亲和力最大可达4.96μM。在大鼠佐剂诱导性关节炎的治疗模型中,AIA模型组及PBS治疗组大鼠足爪明显肿胀,地塞米松治疗组大鼠足爪肿胀情况有所缓解,CRIg-CD59治疗组大鼠足爪肿胀明显缓解;Elisa结果显示CRIg-CD59蛋白治疗组IL-6及TNFα水平明显降低;Micro CT结果显示CRIg-CD59治疗组关节侵蚀及破坏症状显著减轻,关节切片结果显示CRIg-CD59治疗组软骨表面破坏及滑膜增生情况较其他组明显缓解。结论:本课题构建的CRIg-CD59融合蛋白具有良好的体外补体免疫抑制活性,并且与C3裂解产物具有显著的结合能力和较小的解离常数,这使得CRIg-CD59蛋白能够在局部补体激活的情况下富集在大鼠佐剂诱导性关节炎的滑膜及关节上,CRIg-CD59显著抑制了软骨破坏与滑膜增生,体现出了良好的生物学活性。本实验证实CRIg-CD59在大鼠AIA关节炎疾病模型中具有良好的治疗效果。
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