论文部分内容阅读
我国鸭肉产量居世界第一,鸭骨资源极为丰富,但利用率很低。目前,利用血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)类药物抑制血管紧张素转化酶(ACE)的活性是临床治疗高血压的重要途径。食源性降血压肽,也是一种有效的ACEI,且安全无副作用,已成为如今研究的热点及今后预防和治疗高血压疾病的发展趋势。本研究以鸭骨为研究对象,通过木瓜蛋白酶水解制备具有ACE抑制活性的多肽,并对酶解产物进行体外ACE抑制活性的评价,再结合一系列分离纯化研究,旨在探索利用鸭骨蛋白制备高活性ACE抑制肽的工艺路线和工艺参数,为工业化制备ACE抑制肽提供实验依据和理论依据。1.采用木瓜蛋白酶水解鸭骨蛋白制备ACE抑制肽,通过四元二次通用旋转正交实验优化水解工艺,以水解度和ACE抑制率为指标建立数学模型,确定木瓜蛋白酶水解鸭骨蛋白制备ACE抑制肽的最佳酶解工艺。结果表明：木瓜蛋白酶水解鸭骨蛋白制备ACE抑制肽的最佳酶解工艺条件为：底物浓度11.5g/100mL,酶底比8000U/g,水解温度70℃,水解时间5.5h,pH5.5,此条件下酶解产物的ACE抑制率最高,达到85.71%,半抑制浓度(IC5o)为1.73mg/mL,水解度为20.81%。底物浓度(X1)、酶底比(X2)、水解温度(X3)、水解时间(X4)对水解度的影响大小依次为：X2>X3>X4>X1,建立水解度(Y1)与四个因素的回归模型方程为：Y1=23.969+0.175X1+1.455X2+0.959X3+0.426X4-0.053X1X2+0.126X1X3-0.066X1X4+0.10 7X2X3+0.003X2X4+0.367X3X4+0.275X12-0.152X22-0.318X32+0.343X42.四个因素对ACE抑制率的影响大小依次为：X2。建立ACE抑制率(Y2)与四个因素的回归模型方程为：Y2=74.481-5.748X1-2.345X2-5.160X3-7.843X4-3.849X1X4-3.821X12-3.620X32-2.698X42。2.分析水解度与ACE抑制率的相关性,并建立数学模型。结果表明：水解度(X)与ACE抑制率(Y)显著相关(P<0.01),曲线拟合模型方程为：Y=-157.572+21.215X-0.491X2。说明水解度和ACE抑制率在一定范围内呈正相关,当水解度达到某一值后,水解度和ACE抑制率呈负相关；通过验证得到模型拟合成功,可推广应用。3.采用离子交换层析对酶解液进行分离纯化,通过考察缓冲液pH、起始缓冲液离子强度、洗脱液离子强度、上样量、进样流速和洗脱流速对分离效果的影响,获得最适分离纯化条件。结果表明：当上样量为15mg/150mL(肽质量/床体积),起始缓冲液为pH=4.8、0.05mol/L的醋酸钠溶液,洗脱方式为线性梯度洗脱,极限缓冲液为含1.0mol/L NaCl的pH=4.8、0.05mol/L醋酸钠溶液,进样流速和洗脱流速为1.0mL/min时,SP-Sephadex C-25层析柱(Φ2.5×40)分离纯化鸭骨ACE抑制肽效果最佳。分离得到7个ACE抑制活性较高的组分,其中ACE抑制活性最高的组分ACE抑制率为70.52%,IC50为31.14μg/mL。4.采用截留分子量为10KDa、5KDa、3KDa、2KDa四种规格的超滤离心管对酶解液进行超滤分离。结果表明；超滤后,各组分ACE抑制活性大小顺序为：分子量介于2-3KDa组分>分子量大于10KDa组分>分子量小于2KDa组分>分子量介于3-5KDa组分>分子量介于5-10KDa组分,其中分子量范围在2-3KDa的组分ACE抑制活性最高,ACE抑制率为91.37%,其IC50为0.93mg/mL。5.针对超滤后2-3KDa的组分,采用凝胶层析进一步分离纯化,通过考察上样量、进样流速和洗脱流速对分离效果的影响,获得最适分离纯化条件。结果表明：当样液浓度为10mg/mL,上样量为床体积的1.5%(2.25mL),洗脱液为超纯水,进样流速和洗脱流速为0.5mL/min时,Sephadex G-25(细)层析柱(Φ1.6×80)分离纯化鸭骨ACE抑制肽效果最佳。分离得到5个ACE抑制活性较高的组分,其中ACE抑制活性最高的组分ACE抑制率为90.33%,IC50为20.05μg/mL。