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目的:通过研究NRP-1mAb对肝癌HepG2细胞株的生长抑制和促凋亡作用及其机制,并初步探究NRP-1mAb联合rhVEGI-192对肝癌HepG2裸鼠移植瘤的放射增敏作用及其机制,以明确这两种分子靶向药物的抗血管生成作用和抗肿瘤活性,为肝癌的临床治疗提供新的治疗策略和理论依据。方法:体外实验:通过大肠杆菌的原核表达和镍柱纯化等步骤获得rhVEGI-192;通过小鼠腹水法和rProteinA亲和柱纯化等步骤制备NRP-1mAb。SDS-PAGE测定抗体的纯度,BCA法测定抗体的浓度,间接ELISA检测NRP-1mAb的滴度水平。Western blotting检测NRP-1mAb与HepG2细胞结合的特异性,细胞免疫荧光染色和流式细胞术检测NRP-1mAb与HepG2细胞上NRP-1结合的亲和性。MTT检测NRP-1mAb对HepG2细胞的生长抑制作用,ANNEXIN V-FITC/PI流式细胞仪法检测NRP-1mAb对HepG2细胞的促凋亡作用,Western blotting检测ERK1/2、P-ERK1/2、Akt、P-Akt、caspase3、PARP、P38-MAPK、P-P38MAPK蛋白的表达水平。动物实验:构建肝癌HepG2裸鼠移植瘤模型,当瘤体最大径达到0.5cm时,随机分为八组:空白对照组,NRP-1mAb组,rhVEGI-192组,NRP-1mAb+rhVEGI-192 组,10Gy 组,10Gy+NRP-1mAb 组,10Gy+rhVEGI-192组,10Gy+NRP-1mAb+rhVEGI-192 组,每组 8 只。NRP-1mAb 是 10mg/kg 隔天腹腔给药一次,共2周;rhVEGI-192是5mg/kg每天腹腔给药1次,共2周;照射组在实验第9天用10Gy剂量单次照射裸鼠移植瘤部位。隔天测量小鼠体重和移植瘤的体积,计算照射组的增敏系数(SER)。通过Western blotting法检测移植瘤组织中HIF-la、PTEN、caspase3、PARP蛋白的表达水平;免疫荧光化学染色法检测移植瘤组织中血管内皮标志物VE-cadherin、CD31和IV胶原的表达情况。结果:体外实验:rhVEGI-192的纯度超过90%,浓度为1.5mg/mL;NRP-1mAb纯度超过95%,浓度为2mg/mL,效价约为1×10-6，NRP-1mAb不仅能特异性结合HepG2细胞膜上的NRP-1蛋白且与它有较强的亲和性;MTT和ANNEXIN V-FITC/PI流式细胞仪结果显示NRP-1mAb能抑制HepG2细胞的生长并能诱导HepG2细胞的凋亡,作用呈时间和剂量依赖性。Western blotting结果显示P-ERK1/2、P-Akt、caspase3、PARP 蛋白表达下调,P-P38MAPK 蛋白表达上调;动物实验:与空白组相比,实验组小鼠体重变化无明显差异,各组移植瘤的生长受到不同程度的抑制,照射组移植瘤生长被抑制的更明显;10Gy+NRP-1mAb组 SER 为 0,10Gy+rhVEGI-192 组 SER 为 2,10Gy+NRP-1mAb+rhVEGI-192 组SER为4;Western blotting结果显示与空白组相比,NRP-1mAb组,rhVEGI-192组和 NRP-1mAb+rhVEGI-192 组移植瘤中 HIF-la、caspase3、PARP 蛋白表达下调,而PTEN蛋白表达上调。免疫荧光化学染色结果显示:空白组肿瘤血管丰富,曲折,不连续,分支较多,血管粗细不均,基底膜不完整;NRP-1mAb组的血管未见明显改善;rhVEGI-192组移植瘤内的血管在实验第9-11天的形态和结构趋于正常化；NRP-1mAb联合rhVEGI-192组移植瘤内的血管在实验第7-11天内的形态和结构趋于正常化。结论:1.NRP-1mAb抑制HepG2细胞株的生长是通过下调MEK/ERK、PI3K/Akt信号通路来实现的;2.NRP-1mAb诱导HepG2细胞株凋亡是通过上调P38MAPK-caspase3-PAPR信号通路来实现的。3.NRP-1mAb、rhVEGI-192对裸鼠肝癌HepG2移植瘤有明显诱导凋亡的作用,两药联合时促凋亡作用较单药时不明显。4.NRP-1mAb无放射增敏作用;rhVEGI-192有放射增敏作用,使肿瘤血管正常化时间窗是第9-11天;NRP-1mAb联合rhVEGI-192时具有更强的放射增敏作用,使肿瘤血管正常化时间窗是第7-11天。通过比较各组的SER提示NRP-1mAb对rhVEGI-192具有协同作用。5.NRP-1mAb和rhVEGI-192通过上调PTEN和下调HIF-la蛋白表达的途径来改善乏氧,使肿瘤血管趋于正常化,抑制肿瘤新生血管形成,进而具有增强HepG2肝癌移植瘤放射敏感性的作用。