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微生物制药领域近年已成功开发了很多胰岛素类似物。目前胰岛素及其类似物均以酵母表达系统为主。毕赤酵母作为宿主细胞表达外源蛋白已经被成熟地应用在工业生产和实验室研究,然而环境因素对毕赤酵母系统生理代谢和蛋白分泌影响的研究非常少。本论文以猪胰岛素前体(porcine insulin precursor, PIP)为研究对象,探索培养环境条件(溶氧和温度)和蛋白伴侣过表达对不同外源拷贝数毕赤酵母分泌表达PIP的影响。结果如下：(1)通过摇瓶实验和50L多参数全自动发酵罐实验并对蛋白合成和分泌过程的关键酶基因进行转录水平的分析,结果表明：与30℃培养条件相比,低温25℃诱导A2(12拷贝外源基因)和A3(18拷贝外源基因)菌株,PIP表达量分别提高了40%和32%, A3菌株在低温诱导后期细胞存活率提高了20%。低温诱导使得A3重组菌株细胞中有关蛋白折叠BiP蛋白和二硫键形成异构酶PDI1的mRNA转录水平分别降低了35%和27%,有关谷胱甘肽形成谷胱甘肽还原酶GLR1和硫氧还蛋白还原酶TRR1酶的mRNA转录水平也降低了16%。因此,低温诱导对于降低高拷贝菌株细胞中外源蛋白分泌胁迫和氧化胁迫效果显著,从而有利于提高高拷贝菌株细胞存活率及PIP蛋白表达水平。(2)500mL摇瓶分别装液为50ml、100ml和200ml研究不同供氧条件下多拷贝毕赤酵母PIP蛋白表达影响,结果发现：随装液量增加,A2菌株和A3菌株单位OD600细胞PIP表达水平(PIP/OD600)分别下降了36%和28%。同时,发现单位拷贝单位细胞的PIP表达水平和甲醇利用率均以PIP拷贝数最高的重组菌A3为最小。通过对甲醇中心代谢途径的关键酶基因mRNA转录水平定量分析表明,A3菌株细胞中糖酵解途径的GAP基因转录水平下降了16%,三羧酸循环途径的CIT1基因转录水平下降了30%,磷酸戊糖途径的ZWF1基因转录水平下降了15%,说明限制供氧对毕赤酵母的甲醇、中心代谢途径均有抑制作用,减少了碳(甲醇)的代谢通量。对于高拷贝菌株,溶氧限制的影响更体现在对TCA循环的抑制,使得能量形成减少而导致外源蛋白表达量下降。(3)构建蛋白伴侣二硫键异构酶PDI表达载体,发酵培养PDI过表达重组菌A2p。诱导后期A2p的细胞内ROS水平比A2高60%,存活率比A2低25%,PIP产量比A2低38%,说明PDI过表达使细胞受到严重的氧化胁迫,最终导致外源蛋白表达水平降低。