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第一部分AKAP150在慢性束缚应激所致小鼠抑郁样行为中的作用目的:A型激酶锚定蛋白(A-kinase anchoring proteins,AKAPs)是一种特殊的激酶锚定蛋白质家族,该家族蛋白通过共有的两亲性螺旋结构域特异性与蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)调节亚基结合,从而精确调控PKA亚细胞定位。AKAP79/150(A-kinase anchoring proetein 79/150)为AKAPs家族中研究最广泛的一种亚型,主要表达于中枢神经系统。AKAP79/150作为突触后脚手架蛋白参与神经突触功目能调节和记忆形成等过程。基因组学研究显示AKAP79与人类双向情感障碍(bipolar disorder,BD)和精神分裂症发病密切相关。然而目前关于AKAP79/150是否参与抑郁症的病理过程还不清楚。本部分研究通过慢性束缚应激(chronic restraint stress,CRS)模型诱导小鼠抑郁样行为,探索AKAP150分子在抑郁症病理过程中的作用及机制。方法:建立多种不同时长的小鼠束缚应激模型,包括:单次急性束缚应激(acute restraint stress,ARS)和连续 7、14 和 21 天,每天 2 小时 CRS(CRS 7,CRS14 和 CRS 21)。结合糖水偏好检测、悬尾实验和强迫游泳检测以及旷场实验等行为学检测手段评价急、慢性束缚应激暴露对小鼠抑郁样行为及自发活动的影响。利用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测小鼠不同脑区中AKAP150 mRNA的相对表达丰度,应用western blotting检测暴露于不同束缚应激小鼠的BLA脑区中AKAP150的蛋白表达变化。确定有效并可靠的束缚应激模型后,应用慢病毒(lentivirus,LV)载体介导的基因干预技术,结合脑立体定位注射手段在体沉默AKAP150,检测AKAP150在应激诱导的抑郁样行为中的作用。结果:(1)与对照组(Control,CON)相比,ARS和CRS 7不影响小鼠抑郁样行为,而CRS 14和CRS 21诱导小鼠产生明显的抑郁样行为,包括糖水偏好减低(CON:0.81±0.02,ARS:0.74±0.03,CRS7:0.75±0.03,CRS14:0.62±0.05,CRS21:0.63±0.05);悬尾不动时间延长(CON:90.80±4.29s,ARS:90.36±5.09s,CRS7:70.20±5.89s,CRS 14:128.73±9.88s,CRS21:133.00± 10.60s)和强迫游泳不动时间增加(CON:73.20±6.01 s,ARS:68.62±7.32s,CRS7:60.07±9.42s,CRS 14:133.78±7.11s,CRS21:124.6±9.60s)。(2)AKAP150mRNA 在小鼠内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex,mPFC),基底外侧杏仁核(basolateral amygdala,BLA)和海马(hippocampus,HIP)脑区表达相对较高。(3)CRS 14和CRS 21上调小鼠BLA脑区AKAP150蛋白表达,ARS和CRS 7不改变AKAP150蛋白水平(CON:1.00±0.02,ARS:0.85±0.04,CRS7:0.98±0.02,CRS 14:1.37±0.07,CRS21:1.29±0.07)。然而CRS不影响mPFC和HIP脑区AKAP150蛋白水平。(4)与对照组相比,CRS(CRS14)诱导BLA脑区AKAP150向神经元突触部位聚集(CON:1.00±0.04,CRS:1.31±0.07)。(5)BLA 脑区表达 AKAP150shRNA 阻断 CRS 所致小鼠抑郁样行为,包括改善应激小鼠糖水偏好缺失行为(LV-GFP:0.54±0.06,LV-AKAP150 shRNA:0.76±0.03);缩短悬尾不动时间(LV-GFP:122.42±5.94 s,LV-AKAP150 shRNA:76.33±7.00s)和强迫游泳检测中漂浮不动时间(LV-GFP:120.75±7.70s,LV-AKAP150shRNA:73.00±6.76s)。结论:CRS诱导小鼠抑郁样行为;BLA脑区中的锚定蛋白AKAP150参与上述行为改变过程;特异性沉默BLA脑区的AKAP150阻断应激诱导小鼠的抑郁样行为。第二部分AKAP150介导慢性束缚应激所致小鼠抑郁样行为的机制目的:神经系统中AKAP150通过与PKA和蛋白磷酸酶2B(protein phosphatase 2B,PP2B/Calcineurin)结合,控制酶作用于特异性底物参与磷酸化反应。AKAP150锚定激酶介导的磷酸化反应在谷氨酸能系统信号传递和可塑性过程中发挥着重要作用。谷氨酸能系统紊乱与抑郁症的病理生理过程密切相关。然而关于AKAP150介导的磷酸化是否参与应激诱导抑郁症的发生尚不清楚。本部分研究进一步阐述AKAP150介导的磷酸化修饰在小鼠抑郁样行为中的作用及机制。方法:提取CRS模型小鼠BLA脑区组织总蛋白和突触区域蛋白;Western blotting分别检测总蛋白和突触区域蛋白中PKA催化亚基p(PKA catalytic subunit α,PKAc-α)和调节亚基2(PKA regulatory subunit 2,PKA R2)以及AKAP150的另一种结合酶Calcineurin表达水平。采用免疫共沉淀技术检测对照组和模型组小鼠BLA脑区AKAP150与靶向酶PKA结合的改变。利用Ht-31肽特异性地抑制AKAP150与PKA结合,检测AKAP150-PKA信号在应激诱导小鼠抑郁样行为中的作用。利用生物素—亲和素标记、分离、提取BLA脑区细胞膜蛋白,western blotting检测慢性应激对BLA脑区AMPA受体和NMDA受体各亚基的磷酸化和膜表达的影响。检测慢病毒沉默BLA脑区AKAP150以及Ht-31肽干预BLA脑区AKAP150和PKA结合,对α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid,AMPA)和N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体上述改变的影响。全细胞脑片膜片钳方法记录CON组和CRS组小鼠BLA脑区神经元AMPA受体介导的微小兴奋性突触后电流(miniature excitatory postsynaptic currents,mEPSCs)。进一步检测AKAP150 shRNA表达和Ht-31注射对AMPA受体介导的mEPSCs(AMPAR-mEPSCs)的影响,确定AKAP150-PKA信号在AMPA受体功能上的作用。结果:(1)CRS上调小鼠BLA脑区AKAP150靶向激酶PKA含量(PKAc-a:CON:0.98±0.03,CRS:1.20±0.09;PKA R2:CON:1.00±0.06,CRS:1.16±0.04),不影响AKAP150靶向磷酸酶Calcineurin的含量。(2)CRS诱导BLA脑区PKA向神经元突触后聚集(PKAc-α:CON:1.00±0.05,CRS:1.57±0.10;PKAR2:CON:1.00±0.04,CRS:1.45±0.06),促进 AKAP150 与 PKA 结合(CON:1.00±0.04,CRS:1.68±0.20)。(3)与对照肽(control peptide,CP)相比,小鼠 BLA 脑区注射 Ht-31肽,抑制AKAP150和PKA结合,逆转CRS所致糖水偏好降低(CP:0.56±0.07,Ht-31:0.82±0.04);改善 CRS 所致悬尾不动时间增加(CP:136.38± 13.97 s,Ht-31:86.50±8.33s)和强迫游泳漂浮时间延长(CP:112.63± 13.09 s,Ht-31:50.50±6.78s)。(4)沉默BLA脑区AKAP150,阻断CRS所致的GluAl Ser845位点过度磷酸化(LV-GFP:1.45±0.11,V-AKAP150 shRNA:0.96±0.06),抑制GluA上膜(LV-GFP:1.37±0.11,LV-AKAP150shRNA:1.09±0.04)。(5)BLA 脑区注射 Ht-31,逆转 CRS所致 GluAl Ser845 位点磷酸化增强(CP:1.72±0.19,Ht-31:0.96±0.14)和膜表达增加(CP:1.45±0.14,Ht-31:0.90±0.16)。(6)AKAP150 信号不影响 GluN2A/B膜表达。(7)CRS增强BLA脑区AMPAR-mEPSC幅度,这种增强被AKAP150沉默阻断(LV-GFP:17.03±0.67pA,LV-AKAP150shRNA:11.01±0.62pA),被 Ht-31干扰肽注射逆转(CP:18.06± 1.10 pA,Ht-31:12.31 ± 0.46 pA)。CRS、AKAP150 shRNA表达及Ht-31干扰肽注射不影响AMPAR-mEPSC频率。结论:在慢性应激状态下,AKAP150-PKA复合物参与调控BLA脑区AMPA受体介导的谷氨酸能信号传递增强过程,参与应激诱导抑郁样行为过程。抑制AKAP150与PKA的相互作用改善应激状态下的行为异常,提示AKAP150-PKA复合物或许可以成为抑郁症干预治疗中的新靶点。