心肌肌球蛋白的提纯及与柔红霉素作用的荧光研究

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柔红霉素是一种重要的蒽环类抗肿瘤抗生素,能与DNA结合,抑制核酸合成,表现出抗癌活性。但长期使用有心脏毒性,确切的发病机制尚无统一认识。不过,有研究表明,柔红霉素破坏心肌收缩蛋白肌球蛋白-肌动蛋白的横桥循环系统,造成心脏损害。心肌肌球蛋白是心肌细胞的主要结构蛋白和收缩蛋白,其ATP酶活性决定了心肌收缩能力。这是本文研究柔红霉素与心肌肌球蛋白作用的选题依据。此外,柔红霉素存在给电子体,可与蛋白质形成配合物。柔红霉素和蛋白质的研究主要集中于与牛血清白蛋白和人血清白蛋白的相互作用,鲜见与心肌肌球蛋白作用的报道。从心肌肌球蛋白荧光光谱和ATP酶活力的角度出发,探讨柔红霉素与肌球蛋白的结合机理,了解柔红霉素引起心肌收缩功能变化、产生心肌损害的原因,为合理解释柔红霉素引起心脏毒性的分子机制提供依据,是本研究的目的和意义。论文介绍了几种药物与蛋白质作用的近代研究方法,其中,灵敏简便的荧光光谱法是重要的手段。总结了心肌肌球蛋白提取的一般方法和纯化效果,并对这些方法加以改进,从猪心肌组织中提取纯化了肌球蛋白。考察了柔红霉素对肌球蛋白ATP酶活力的影响,讨论了柔红霉素与心肌肌球蛋白作用的荧光猝灭行为。研究内容如下:1.心肌肌球蛋白的分离纯化及其ATP酶活力测定用硫酸铵沉淀法,即用饱和度36%~41%的硫酸铵,从猪左心室中提取肌球蛋白。测定了各分级段肌球蛋白的含量,根据酶反应ATP分解释放的无机磷含量,绘制了酶动力学曲线,检测了Ca2+激活肌球蛋白ATP酶活性。求得肌球蛋白活力收得率和纯化倍数分别为39.4%和4.7。用不连续的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和反相高效液相色谱表达了肌球蛋白的纯化程度。该结果与传统方法相比,有操作简单、耗时少,得率高并保持了酶活的优点。2.柔红霉素对肌球蛋白ATP酶活力的作用纯化的另一重要部分是测定目标蛋白的活力,肌球蛋白Ca2+激活ATPase酶是最有用的测活方式之一。因此,研究了柔红霉素对肌球蛋白Ca2+激活ATPase活力的作用。实验结果表明,肌球蛋白酶活性的损失随柔红霉素浓度和作用时间的增加而增大,直至影响肌球蛋白的生理功能。考察了Mg2+浓度对肌球蛋白和柔红霉素-肌球蛋白两种体系Ca2+-ATP酶活力的影响。研究发现,Mg2+浓度相同时,柔红霉素-肌球蛋白体系酶活力小于肌球蛋白体系;低浓度的Mg2+即可抑制柔红霉素造成的肌球蛋白ATP酶活力下降。研究了pH值对柔红霉素-肌球蛋白体系ATP酶活力的影响。结果表明,pH值相同时,体系的Mg2+-ATP酶活力大于Ca2+-ATP酶活力;弱酸环境下,Ca2+-ATP酶活性较高,是导致癌症患者心力衰竭的原因之一。3.柔红霉素对心肌肌球蛋白的荧光猝灭行为研究了20℃,pH7.4的Tris-HCl缓冲液中,柔红霉素对肌球蛋白的荧光猝灭作用。结果表明,肌球蛋白的Stern-Volmer曲线呈非线性,证实柔红霉素与肌球蛋白的作用不是动态猝灭而是静态猝灭。求得猝灭常数1.337×105 L·mol-1,结合常数2.649×102 L·mol-1。二者的作用是自由能降低的分子自发过程。考察了pH值、缓冲体系和温度对柔红霉素与肌球蛋白荧光猝灭的影响。不同pH值对猝灭常数有较大影响,并按照pH6.5~7.4(中性)、pH8.0~9.0(弱碱)、pH4.0~6.0(弱酸)顺序递增。此外,pH小于5.5时,结合常数比其它pH时大。Tris-HCl缓冲体系中,柔红霉素对肌球蛋白荧光强度的猝灭程度比在Citric acid-Na2HPO4和KH2PO4-K2HPO4缓冲体系中的强;并在pH6.5~7.4时,猝灭常数保持不变。15℃~37℃范围内,求得体系的荧光猝灭常数,并以此推断肌球蛋白的荧光猝灭类型。同时发现,生理温度下,柔红霉素与肌球蛋白的作用增强,荧光猝灭程度比其它温度时大。4.金属离子对柔红霉素与肌球蛋白荧光体系的作用Ca2+、Mg2+不仅对肌球蛋白的荧光有猝灭作用,并能增强柔红霉素对肌球蛋白的荧光猝灭。求出了不同Ca2+、Mg2+浓度下,体系的猝灭常数和结合常数;解释了异常离子浓度引起柔红霉素心脏毒性的原因。Zn2+对肌球蛋白的猝灭机理比Cu2+复杂,同时包含了动态和静态两种猝灭方式。Zn2+、Cu2+浓度比为10︰1时,金属离子与柔红霉素竞争结合肌球蛋白,降低了柔红霉素对肌球蛋白的猝灭作用,抑制其心脏毒性。Zn2+、Cu2+浓度比为100︰1时,两者的作用增强,体系猝灭常数最大,影响肌球蛋白的正常生理功能。这一结果与癌症患者体内Zn2+、Cu2+比值较高的报道相吻合。不同浓度的Se4+均使肌球蛋白的荧光强度降低,且高浓度时的△F比低浓度时小。而对柔红霉素-肌球蛋白体系,随Se4+浓度的增大,荧光强度表现出猝灭、增敏和无变化三种趋势。Se4+浓度1.2×10-5 mol·L-1时,增敏作用最强,且△F与柔红霉素浓度线性关系良好,可建立一种测定柔红霉素浓度的新荧光方法。Se4+浓度超过2.0×10-5 mol·L-1时,体系的荧光强度不再随DNR浓度的增加而变化,说明一定浓度的Se4+能减轻DNR毒副作用对心脏的损害。
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