癌症基因组包含着不同的体细胞遗传变异形式,从核苷酸水平的变异(包括点突变和小的插入/缺失)到染色体水平的结构突变/结构变异(structural mutations,SMs)/(structural variations,SVs)(包括染色体重排和拷贝数改变),其中某些可能是促进肿瘤发生发展的驱动突变。研究显示,SVs可通过直接破坏抑癌基因的结构和功能、造成重要癌基因的拷贝数增加、形成新的致瘤性融合基因等多种途径促进肿瘤的发生发展。因此,全面鉴别肿瘤基因组中SVs区域、并对其中受累基因进行功能研究,是发现肿瘤发生中关键驱动基因的有力途径。我国是食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)发病率及死亡率最高的国家,最近几年里我们及其他学者已经通过二代测序鉴定出了食管鳞癌中发生频繁突变的驱动基因,包括诸如TP53、PIK3CA、NOTCH1、CDKN2A等明星基因,以及新的如ZNF750、AJUBA、FAT1等新的ESCC相关基因,并对关键基因的功能和机制做了深入研究,而覆盖ESCC整个基因组的SVs及其机制、以及受SVs影响的关键基因仍未知。目的:基因组学水平分析食管鳞癌基因组结构突变,包括染色体重排和拷贝数变异。绘制食管鳞癌结构突变频谱及发生机制频谱,鉴定染色体碎裂、基因融合、BFB循环和kataegis等复杂结构突变在食管鳞癌中的发生频率及影响的靶基因;基于结构突变筛选新的驱动食管鳞癌发生的基因,明确其表达水平变化及对食管鳞癌细胞增殖、侵袭及迁移能力的影响,并初步探讨其作用机制。方法:1.从ega(europeangenome-phenomearchive)下载31例escc肿瘤及匹配正常食管组织的全基因组测序数据,用生物信息学方法针对基因组结构突变进行重新分析,绘制食管鳞癌结构突变频谱及发生机制频谱,鉴定食管鳞癌中染色体碎裂、基因融合、bfb循环和kataegis等复杂结构重排的频率及受影响靶基因。2.fish技术验证相应食管鳞癌标本中染色体碎裂导致的fgfr1和letm2扩增、bfb循环导致的ccnd1基因扩增;fish技术和pcrsanger测序检测融合基因及转录本。3.免疫组织化学方法检测食管鳞癌组织芯片中letm2蛋白表达情况;rnai干扰食管鳞癌细胞内源性fgfr1和letm2,westernblot验证基因干扰效率,mtt实验、transwell实验观察对细胞增殖、侵袭和迁移的影响。4.patchwork和gistic方法联合分析31例escc全基因组测序数据和123例cgh数据,鉴定食管鳞癌全基因组拷贝数变异特征及区域,进一步从中筛选食管鳞癌发生的新驱动基因。5.采用rt-pcr和基于组织芯片的免疫组织化学方法检测食管鳞癌组织及正常食管粘膜组织中cdca7mrna和蛋白表达差异;rnai干扰内源性cdca7水平,westernblot验证基因干扰效率,mtt实验、transwell实验、流式细胞实验观察对食管鳞癌细胞增殖、侵袭、迁移和细胞凋亡的影响。6.rnaseq检测稳定敲低cdca7后基因表达差异,筛选与细胞增殖和凋亡相关的差异表达基因,绘制cdca7影响食管鳞癌细胞增殖和凋亡的靶通路;westernblot验证靶通路表达水平。结果:1.31个escc基因组中共发现5204个结构突变,平均每例包含168个;观察到缺失、末端复制、倒位、插入和染色体易位5个突变类型,其中染色体易位和缺失是escc中的主要结构突变类型,分别占比42%和35%。2.造成escc中结构突变的主要机制是nhej和alt-ej。3.3376个结构突变发生在基因区,并直接破坏基因序列;结构突变造成了escc中重要肿瘤抑制基因cdkn2a(13/31)和notch1(2/31)基因的缺失或失活。4.31例escc中发现了1例染色体碎裂,导致染色体8p12的高度扩增,fish实验验证了该区域包含的fgfr1和letm2扩增是由于染色体碎裂伴随的dms形成所导致;免疫组化结果显示letm2蛋白在escc肿瘤组织中过表达;rnai、mtt、transwell等实验发现fgfr1促进食管鳞癌细胞增殖、侵袭和迁移,letm2促进食管鳞癌细胞增殖,但对侵袭和迁移无影响。5.31例escc基因组中共鉴定出了173个框内融合基因和231个不符合读码框架的融合基因;通过分析参与融合事件的基因功能以及融合事件对基因结构的影响,筛选出了可能在escc发生发展过程中起驱动作用的trappc9-clvs1、eif3e-rad51b融合基因;fish验证了基因组水平融合事件、pcrsanger测序验证了在相应食管鳞癌组织中存在融合基因转录本。6.在escc-14t的3号染色体局灶(范围16.9-17.5mb)集中了大量染色体重排,同时发生了成簇的核苷酸突变,并且高度突变区域内的突变以tpcpx三核苷酸中的c>t颠换为主,提示kataegis在escc中具有潜在致瘤作用。7.bfb循环是escc中导致癌基因扩增的重要机制,31例escc中共有21例发生了bfb,其中9例导致ccnd1扩增,其余分别导致egfr、erbb2、mmps和myc等癌基因扩增;fish结果证实ccnd1信号在等位基因区域呈现不平衡状态;另外,ccnd1所在的11号染色体富集了染色体间svs,提示ccnd1在escc中扩增机制至少有两种。8.对31例escc的拷贝数变异分析发现,其中19例可以判断出绝对拷贝数;其中包含着频繁的3q、5p、7p、8q、12p、17p、20p、20q的拷贝数扩增和3p、4p、4q、5q、10p、13q、21q拷贝数缺失;escc中70%的杂合性缺失是拷贝数中立的杂合性缺失,以13q和17p为著;31例escc中有13例存在wgd现象,提示cn-loh和wgd可能对escc发生发展具有重要意义。9.应用gistic分析31例escc的全基因组测序数据和123例escc的cgh数据,鉴定出了11个扩增峰和13个缺失峰,包括egfr、cdk6、akt1、myc、ccnd1和cdkn2a等已知在escc中存在拷贝数变异基因所在区域。10.鉴定出了escc基因组中新的高度扩增区域——2q31,rt-pcr和ihc结果证实其中的靶基因cdca7在食管鳞癌组织中表达增高(p<0.001)。11.稳定敲低ECA109细胞中CDCA7水平明显抑制细胞增殖、促进细胞凋亡(p<0.05),但对细胞侵袭和迁移无影响,提示CDCA7是ESCC细胞增殖和凋亡相关基因。12.RNA-seq显示稳定敲低CDCA7后,FGF21、CASP10、IL1R1、CASP7、BCL2、CASP9、TRAIL-R等增殖和凋亡相关基因表达差异;Western blot实验显示敲低CDCA7后pERK1/2水平降低;DAVID绘制差异基因功能通路,提示CDCA7可能通过调节FGF21-ERK1/2-MAPK通路发挥促增殖和抗凋亡的作用。结论:1.食管鳞癌基因组中存在着大量结构突变,包括缺失、末端复制、倒位、插入和染色体易位5种类型,其中以缺失和染色体易位为主。2.染色体碎裂、Kataegis和BFB等复杂结构重排在食管鳞癌中具有一定发生频率,并导致FGFR1、LETM2、CCND1等癌基因的扩增和潜在致癌融合基因TRAPPC9-CLVS1、EIF3E-RAD51B形成。3.拷贝数中立的杂合性缺失和全基因组复制普遍存在是食管鳞癌拷贝数变异的特征,可能对食管鳞癌发生发展具有重要意义。4.CDCA7基因是通过拷贝数变异分析筛选出的新的食管鳞癌相关基因,在食管鳞癌中发生拷贝数扩增和过表达,促进食管癌细胞增殖、抑制其凋亡,可能是新的食管鳞癌发生发展的驱动基因。