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目的：血管生成素(Angiogenin, ANG)是较早发现的具有很强促进血管生成活性的促血管生长因子之一，参与调节新血管生成和维持血管稳定，并且ANG是其他血管生成因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等重要促血管生长因子发挥促进血管生长作用的必需和准许因子。ANG也存在于多种人体组织和体液中，可能参与人体内多种生理、病理过程。再者，2016年新发现ANG在血液干细胞、皮肤干细胞以及肿瘤干细胞中扮演干细胞调节者的角色，ANG还具有不同细胞特异性功能，使原始干细胞趋向静止状态但却促进前体干细胞增殖；因此，将可能在移植、组织修复以及干细胞应用工程等方面治疗潜力非常广阔。在肿瘤的发生发展中，ANG表现出促进血管内皮细胞增殖，又促进癌细胞增殖的双重作用。此外，研究发现在人体组织和体液中如血浆、血清、羊水、卵泡液等检测到ANG的存在，从而推测其在女性生殖疾病的发生发展中可能发挥作用；前期我们饲养C57BL/6J小鼠的过程中发现，ANG基因敲除小鼠(Ang(-/-))繁殖能力明显低于野生型(wide type, WT)小鼠(Ang(+/+))，表现为小鼠的生育率、产仔数降低；因此，深入研究ANG与女性生殖之间的关系，将可能为女性生殖相关疾病的诊断和治疗提供新的思路。本课题欲从小鼠生育率、产仔数、动情周期情况、不同时期的卵巢组织形态以及卵泡数等方面初步探讨ANG基因敲除对小鼠卵巢功能的影响。论文分为两部分进行阐述，如下：
第一部分血管生成素基因敲除对小鼠卵巢功能影响的初步研究
方法：本试验中所用C57BL/6JANG基因敲除型纯合子Ang(-/-)及杂合子Ang(+/-)型雌性种鼠各2只，共4只由浙江大学医学院许正平教授馈赠，在本校实验中心饲养繁殖，进一步按照美国TuftsUniversity胡国富教授实验室鉴定方法进行鉴定。从以下三个方面观察比较Ang(-/-)和WT(Ang(+/+))小鼠卵巢功能情况：1)8周龄雌性小鼠，每组20只，两组小鼠分别与WT雄性小鼠按1:1交配1w，取出雄鼠后雌鼠继续连续观察21天，计数两组的平均受孕率及平均每胎产仔数；2)8周龄雌性小鼠，每组3只，每只小鼠用阴道涂片法连续观察动情周期情况35天；3)每组12只雌性小鼠，每阶段3只分别于4、6、8、12周龄时脱颈处死，剖开腹腔，取出卵巢组织固定、石蜡包埋、切片，HE染色观察卵巢组织形态，对卵巢组织中的各级卵泡数目分别进行计数与统计分析。
结果：
1、生育能力观测：结果表明Ang(-/-)雌性小鼠的受孕率及平均每胎产仔数下降。WT组受孕率47.50%，Ang(-/-)组受孕率40.00%，两组间无显著性差异(P=0.342)；WT组平均每胎产仔数7.20±1.15，Ang(-/-)组平均每胎产仔数4.55±0.94，与WT组相比，平均每胎产仔数极显著下降(P<0.001)。
2、阴道涂片法观察动情周期：结果表明雌性Ang(-/-)小鼠动情周期出现紊乱，WT组小鼠平均动情期(8.33±1.03)天，Ang(-/-)组(1±0.89)天，动情期较WT组极显著缩短(P<0.001)；WT组小鼠平均动情间期(6.17±0.75)天，Ang(-/-)组(12.5±1.38)天，动情间期较WT组很显著延长(P<0.002)；WT组小鼠平均动情前期(4.00±0.63)天，Ang(-/-)组(8.83±1.17)天，动情前期较WT组有很显著延长(P=0.003)；动情后期两组间无显著差异。
3、卵巢组织形态观察：4、6周龄小鼠卵巢组织形态两组无显著差别；8和12周龄Ang(-/-)小鼠卵巢组织结构紊乱、皮质闭锁卵泡明显可见，卵巢间质增生增厚，黄体颗粒细胞排列疏松且不规则。
4、4、6、8、12周龄小鼠卵巢各级卵泡数比较
1)原始卵泡数：①4W：WT组平均原始卵泡数125.33±11.33，Ang(-/-)组119.83±2.79(P=0.137)；②6W：WT组118.23±10.36，Ang(-/-)组115.00±5.87(P=0.355)；③8W：WT组64.00±5.22，Ang(-/-)组62.33±5.54(P=0.793)；④12W：WT组33.17±6.08，Ang(-/-)组27.43±5.38(P=0.979)，各阶段平均原始卵泡数两组间比较均无显著性差异。
2)初级卵泡数：①4W：WT组平均初级卵泡数26.33±5.32，Ang(-/-)组15.50±3.83，较之WT组极显著性降低(P<0.001)；②6W：WT组18.33±3.61，Ang(-/-)组9.33±3.01，较之WT组极显著性降低(P<0.001)；③8W：WT组13.17±2.32，Ang(-/-)组9.33±3.67，两组间比较无显著性差异(P=0.401)；④12W：WT组9.50±2.17，Ang(-/-)组7.50±2.07，两组间比较无显著性差异(P=0.126)。
3)次级卵泡数：①4W：WT组平均次级卵泡数22.67±3.01，Ang(-/-)组14.83±3.06，较之WT组极显著性降低(P<0.001)；②6W：WT组11.73±2.48，Ang(-/-)组4.53±1.47，较之WT组极显著性降低(P<0.001)；③8W：WT组11.33±2.73，Ang(-/-)组5.50±1.86，较之WT组极显著性降低(P<0.001)；④12W：WT组6.50±1.87，Ang(-/-)组3.87±1.47，两组间比较无显著性差异(P=0.496)。
4)窦状卵泡数：①4W：WT组平均窦状卵泡数13.50±2.59，Ang(-/-)组9.17±1.47，较之WT组很明显降低(P=0.0051)；②6W：WT组11.50±2.59，Ang(-/-)组9.33±2.07，两组间比较无显著性差异(P=0.493)；③8W：WT组8.67±1.75，Ang(-/-)组6.66±2.42，两组间比较无显著性差异(P=0.275)；④12W：WT组7.17±2.15，Ang(-/-)组6.15±1.72，两组间比较无显著性差异(P=0.638)。
5)闭锁卵泡数：①4W：WT组平均闭锁卵泡数10.50±2.66，Ang(-/-)组28.50±2.59，较之WT组极显著性升高(P<0.001)；②6W：WT组36.67±3.83，Ang(-/-)组42.64±6.19，两组间比较无显著性差异(P=0.071)③8W：WT组41.17±3.76，Ang(-/-)组50.68±4.41，较之WT组很明显升高(P=0.003)④12W：WT组53.33±5.72，Ang(-/-)组62.15±8.33，两组间比较无显著性差异(P=0.058)。
6)黄体数：①4W：WT组平均黄体数7.00±1.41，Ang(-/-)组6.17±2.14，两组间比较无显著性差异(P=0.406)；②6W：WT组10.50±1.87，Ang(-/-)组8.69±2.16，两组间比较无显著性差异(P=0.147)；③8W：WT组13.85±2.64，Ang(-/-)组5.00±1.67，较之WT组极显著降低(P<0.001)④12W：WT组8.13±2.93，Ang(-/-)组4.50±2.07，较之WT组极显著降低(P=0.031)。
结论：综上实验结果表明C57BL/6J雌性小鼠Ang基因敲除后，与正常WT小鼠相比，生育力显著性降低，表现为每胎产仔数量明显下降；影响动情周期，主要表现为动情周期紊乱，动情期明显减少，动情前和动情间期明显延长；影响各阶段各级卵泡发育成熟但以早期4W最为明显，表现为4W生长卵泡数包括初级、次级、窦状卵泡均显著性下降，但不影响排卵，因为4W黄体数并没有明显下降；促进卵泡闭锁，表现为4和8W闭锁卵泡明显增加；影响晚期排卵，表现为8和12W，窦状卵泡无明显差异但黄体数却明显减少；影响卵巢组织结构，表现为8和12W小鼠卵巢组织结构紊乱、皮质闭锁卵泡明显可见，卵巢间质增生增厚，黄体颗粒细胞排列疏松且不规则。表明Ang基因敲除对小鼠卵巢功能有明显影响。
第二部分血管生成素基因敲除对环磷酰胺诱导卵巢早衰的影响
在第一部分证明Ang基因敲除对小鼠卵巢功能有明显影响的情况下，本部分设计试验为进一步了解Ang基因敲除对病理条件下卵巢功能是否产生影响。化疗导致的卵巢早衰(premature ovary failure, POF)或卵巢功能不全经常发生，化疗药物如环磷酰胺(cyclophosphate, CTX)等对卵巢功能的损伤近年来受到了普遍的关注，因此，对化疗药物导致卵巢功能损害的保护机制与治疗方法的研究日益显得迫切与需要。本部分用环磷酰胺对血管生成素基因敲除小鼠卵巢功能形成冲击，以观察Ang基因敲除是否会加重或者缓解POF，以进一步了解Ang基因敲除对病理条件下卵巢功能的影响，并将可能为POF诊断和治疗提供新的思路。
方法：8周龄C57BL/6J雌性小鼠分为三组：正常组(WT)，CTX组(WT＋CTX)，Ang(-/-)+CTX组，每组6只。CTX组和Ang(-/-)+CTX组小鼠均接受POF造模方法，即第一天腹腔注射负荷剂量CTX50mg.kg-1.d-1，第二天开始给予8mg.kg-1.d-1维持剂量，连续腹腔注射14天，正常组小鼠分别于对应时间腹腔注射等体积的生理盐水，期间观察记录小鼠一般状况，最后一次给药24h后所有小鼠双眼摘眼球取血，分离血清-80℃保存待测，随即脱颈处死小鼠，称量体重，剖腹，取出卵巢，称量卵巢湿重，计算卵巢指数，左侧卵巢组织固定、石蜡包埋、切片，HE染色观察卵巢形态、各级卵泡观察计数，统计占比情况；右侧卵巢组织固定、石蜡包埋，切片，采用VG染色观测各组小鼠卵巢纤维化程度。后期采用酶联免疫吸附法检测各鼠血清雌二醇(estrogen, E2)、促卵泡激素(follical-stimulating hormones, FSH)、抗苗勒氏管激素(anti-Muller tube hormones, AMH)水平。结果如下：
1、卵巢湿重及卵巢指数
1)卵巢湿重比较：正常组(0.0024±0.0004)g，CTX组(0.0010±0.0003)g，Ang(-/-)+CTX组(0.0007±0.0003)g，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组与CTX组间无显著性差异(P=0.152)。
2)卵巢重量指数比较：正常组(0.0107±0.0007)，CTX组(0.0044±0.0009)，Ang(-/-)+CTX组(0.0038±0.0017)，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组与CTX组间无显著性差异(P=0.342)。
2、各级卵泡数计数比较
1)原始卵泡数：正常组(50.13±8.79)个，CTX组(29.75±5.20)个，Ang(-/-)+CTX组(9.00±3.34)个，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组极显著低于CTX组(P<0.001)。
2)初级卵泡数：正常组(13.13±3.60)个，CTX组(9.25±2.38)个，Ang(-/-)+CTX组(4.25±1.16)个，CTX组很显著低于正常组(P=0.007)，Ang(-/-)+CTX组亦很显著低于CTX组(P=0.001)。
3)次级卵泡数：正常组(11.25±4.40)个，CTX组(8.50±2.20)个，Ang(-/-)+CTX组(4.50±1.31)个，CTX组与正常组比较无显著差别(P=0.075)，Ang(-/-)+CTX组明显低于CTX组(P=0.013)。
4)窦状卵泡数：正常组(6.63±2.07)个，CTX组(2.13±1.81)个，Ang(-/-)组(1.25±1.16)个，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组与CTX组比较无明显差异(P=0.321)。
5)闭锁卵泡数：正常组(15.75±3.45)个，CTX组(33.88±8.79)个，Ang(-/-)+CTX组(42.50±7.54)个，CTX组极显著高于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组很显著高于CTX组(P=0.002)。
6)黄体数数：正常组(7.50±2.56)个，CTX组(3.25±2.25)个，Ang(-/-)+CTX组(1.75±1.58)个，CTX组很显著低于正常组(P=0.001)，Ang(-/-)+CTX组与CTX组间无明显差异(P=0.182)。
3、总卵泡数以及各级卵泡数占比比较：
1)总卵泡数：正常组(104.38±16.03)个，CTX组(86.75±8.63)个，Ang(-/-)+CTX组(63.25.±20.41)个，CTX组很显著性低于正常组(P=0.006)，Ang(-/-)+CTX组很显著低于CTX组(P=0.001)。
2)原始卵泡数占比：正常组(47.93±2.88)%，CTX组(34.26±4.86)%，Ang(-/-)+CTX组(14.15±4.37)%，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组极显著低于CTX组(P<0.001)。
3)初级卵泡数占比：正常组(12.51±2.73)%，CTX组(10.78±3.13)%，Ang(-/-)+CTX组(6.70±1.41)%，CTX组与正常组无显著差异(P=0.188)，Ang(-/-)+CTX组很显著低于CTX组(P=0.004)。
4)次级卵泡数占比：正常组(10.63±3.28)%，CTX组(9.81±2.40)%，Ang(-/-)+CTX组(7.21±2.41)%，CTX组与正常组无显著差异(P=0.551)，Ang(-/-)+CTX组与CTX组亦无显著差异(P=0.071)。
5)窦状卵泡数占比：正常组(6.24±1.19)%，CTX组(2.52±2.15)%，Ang(-/-)+CTX组(1.87±1.71)%，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组与CTX组无显著差异(P=0.461)。
6)闭锁卵泡数占比：正常组(15.41±4.14)%，CTX组(38.76±7.79)%，Ang(-/-)+CTX组(67.21±8.79)%，CTX组明显高于正常组(P=0.022)，Ang(-/-)+CTX组极显著高于CTX组(P<0.001)。
7)黄体数占比：正常组(7.28±2.47)%，CTX组(3.87±2.99)%，Ang(-/-)+CTX组(2.86±2.81)%，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)组与CTX组无显著差异(P=0.472)。
4、性激素水平测定结果：
1)AMH：正常组(7.36±0.55)pg/ml，CTX组(2.85±0.38)pg/ml，Ang(-/-)+CTX组(1.70±0.63)pg/ml，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组极显著显著低于CTX组(P<0.001)。
2)E2：正常组(35.99±1.13)pg/ml，CTX组(23.81±1.03)pg/ml，Ang(-/-)+CTX组(18.85±1.06)pg/ml，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组极显著低于CTX组(P<0.001)。
3)FSH：正常组(2.35±0.41)mIU/ml，CTX组(3.42±0.34)mIU/ml，Ang(-/-)+CTX组(6.08±0.33)mIU/ml，CTX组极显著高于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组极显著高于CTX组(P<0.001)。
5、卵巢组织学观测结果
CTX组卵巢组织较之正常组明显萎缩，组织结构紊乱，间质坏死，伴有纤维化，皮质见较多闭锁卵泡和卵泡坏死；Ang(-/-)+CTX组小鼠卵巢组织相比于CTX组更明显萎缩，组织结构紊乱明显，有大量的闭锁卵泡和大量的卵泡坏死，生长卵泡少见，间质纤维化程度明显增高。
结论：综上结果表明，C57BL/6J正常雌性小鼠经CTX处理后，与正常雌性小鼠相比，CTX组小鼠卵巢重量和卵巢指数极显著降低，卵巢组织萎缩，结构紊乱，间质坏死，皮质见较多闭锁卵泡和卵泡坏死，伴有纤维化，总卵泡数、原始、初级、窦状卵泡数均显著性下降，闭锁卵泡数显著增加，黄体数目显著下降，其中，原始卵泡、窦状卵泡和黄体占比明显下降，闭锁卵泡占比明显增加，且FSH水平显著升高，AMH和E2水平均显著降低，表明CTX诱导了明显的卵巢早衰。与CTX组相比，Ang(-/-)+CTX组小鼠卵巢组织进一步萎缩，结构更加紊乱，闭锁卵泡和卵泡坏死加重，纤维化程度加重，总卵泡数及各级生长卵泡数进一步明显减少，闭锁卵泡数明显增多，但对窦状卵泡数和黄体数影响不明显，其中原始卵泡、初级卵泡占比明显下降，闭锁卵泡占比明显增加，且FSH水平显著升高，小鼠血清AMH和E2水平均显著降低，FSH水平显著增加，表明Ang基因敲除进一步加重了CTX导致的卵巢早衰，这可能与Ang基因缺陷影响血管生成，影响原始卵泡及卵泡发育，促进卵泡闭锁，并进一步影响激素分泌，即降低AMH和E2水平，上调FSH水平有关。
第一部分血管生成素基因敲除对小鼠卵巢功能影响的初步研究
方法：本试验中所用C57BL/6JANG基因敲除型纯合子Ang(-/-)及杂合子Ang(+/-)型雌性种鼠各2只，共4只由浙江大学医学院许正平教授馈赠，在本校实验中心饲养繁殖，进一步按照美国TuftsUniversity胡国富教授实验室鉴定方法进行鉴定。从以下三个方面观察比较Ang(-/-)和WT(Ang(+/+))小鼠卵巢功能情况：1)8周龄雌性小鼠，每组20只，两组小鼠分别与WT雄性小鼠按1:1交配1w，取出雄鼠后雌鼠继续连续观察21天，计数两组的平均受孕率及平均每胎产仔数；2)8周龄雌性小鼠，每组3只，每只小鼠用阴道涂片法连续观察动情周期情况35天；3)每组12只雌性小鼠，每阶段3只分别于4、6、8、12周龄时脱颈处死，剖开腹腔，取出卵巢组织固定、石蜡包埋、切片，HE染色观察卵巢组织形态，对卵巢组织中的各级卵泡数目分别进行计数与统计分析。
结果：
1、生育能力观测：结果表明Ang(-/-)雌性小鼠的受孕率及平均每胎产仔数下降。WT组受孕率47.50%，Ang(-/-)组受孕率40.00%，两组间无显著性差异(P=0.342)；WT组平均每胎产仔数7.20±1.15，Ang(-/-)组平均每胎产仔数4.55±0.94，与WT组相比，平均每胎产仔数极显著下降(P<0.001)。
2、阴道涂片法观察动情周期：结果表明雌性Ang(-/-)小鼠动情周期出现紊乱，WT组小鼠平均动情期(8.33±1.03)天，Ang(-/-)组(1±0.89)天，动情期较WT组极显著缩短(P<0.001)；WT组小鼠平均动情间期(6.17±0.75)天，Ang(-/-)组(12.5±1.38)天，动情间期较WT组很显著延长(P<0.002)；WT组小鼠平均动情前期(4.00±0.63)天，Ang(-/-)组(8.83±1.17)天，动情前期较WT组有很显著延长(P=0.003)；动情后期两组间无显著差异。
3、卵巢组织形态观察：4、6周龄小鼠卵巢组织形态两组无显著差别；8和12周龄Ang(-/-)小鼠卵巢组织结构紊乱、皮质闭锁卵泡明显可见，卵巢间质增生增厚，黄体颗粒细胞排列疏松且不规则。
4、4、6、8、12周龄小鼠卵巢各级卵泡数比较
1)原始卵泡数：①4W：WT组平均原始卵泡数125.33±11.33，Ang(-/-)组119.83±2.79(P=0.137)；②6W：WT组118.23±10.36，Ang(-/-)组115.00±5.87(P=0.355)；③8W：WT组64.00±5.22，Ang(-/-)组62.33±5.54(P=0.793)；④12W：WT组33.17±6.08，Ang(-/-)组27.43±5.38(P=0.979)，各阶段平均原始卵泡数两组间比较均无显著性差异。
2)初级卵泡数：①4W：WT组平均初级卵泡数26.33±5.32，Ang(-/-)组15.50±3.83，较之WT组极显著性降低(P<0.001)；②6W：WT组18.33±3.61，Ang(-/-)组9.33±3.01，较之WT组极显著性降低(P<0.001)；③8W：WT组13.17±2.32，Ang(-/-)组9.33±3.67，两组间比较无显著性差异(P=0.401)；④12W：WT组9.50±2.17，Ang(-/-)组7.50±2.07，两组间比较无显著性差异(P=0.126)。
3)次级卵泡数：①4W：WT组平均次级卵泡数22.67±3.01，Ang(-/-)组14.83±3.06，较之WT组极显著性降低(P<0.001)；②6W：WT组11.73±2.48，Ang(-/-)组4.53±1.47，较之WT组极显著性降低(P<0.001)；③8W：WT组11.33±2.73，Ang(-/-)组5.50±1.86，较之WT组极显著性降低(P<0.001)；④12W：WT组6.50±1.87，Ang(-/-)组3.87±1.47，两组间比较无显著性差异(P=0.496)。
4)窦状卵泡数：①4W：WT组平均窦状卵泡数13.50±2.59，Ang(-/-)组9.17±1.47，较之WT组很明显降低(P=0.0051)；②6W：WT组11.50±2.59，Ang(-/-)组9.33±2.07，两组间比较无显著性差异(P=0.493)；③8W：WT组8.67±1.75，Ang(-/-)组6.66±2.42，两组间比较无显著性差异(P=0.275)；④12W：WT组7.17±2.15，Ang(-/-)组6.15±1.72，两组间比较无显著性差异(P=0.638)。
5)闭锁卵泡数：①4W：WT组平均闭锁卵泡数10.50±2.66，Ang(-/-)组28.50±2.59，较之WT组极显著性升高(P<0.001)；②6W：WT组36.67±3.83，Ang(-/-)组42.64±6.19，两组间比较无显著性差异(P=0.071)③8W：WT组41.17±3.76，Ang(-/-)组50.68±4.41，较之WT组很明显升高(P=0.003)④12W：WT组53.33±5.72，Ang(-/-)组62.15±8.33，两组间比较无显著性差异(P=0.058)。
6)黄体数：①4W：WT组平均黄体数7.00±1.41，Ang(-/-)组6.17±2.14，两组间比较无显著性差异(P=0.406)；②6W：WT组10.50±1.87，Ang(-/-)组8.69±2.16，两组间比较无显著性差异(P=0.147)；③8W：WT组13.85±2.64，Ang(-/-)组5.00±1.67，较之WT组极显著降低(P<0.001)④12W：WT组8.13±2.93，Ang(-/-)组4.50±2.07，较之WT组极显著降低(P=0.031)。
结论：综上实验结果表明C57BL/6J雌性小鼠Ang基因敲除后，与正常WT小鼠相比，生育力显著性降低，表现为每胎产仔数量明显下降；影响动情周期，主要表现为动情周期紊乱，动情期明显减少，动情前和动情间期明显延长；影响各阶段各级卵泡发育成熟但以早期4W最为明显，表现为4W生长卵泡数包括初级、次级、窦状卵泡均显著性下降，但不影响排卵，因为4W黄体数并没有明显下降；促进卵泡闭锁，表现为4和8W闭锁卵泡明显增加；影响晚期排卵，表现为8和12W，窦状卵泡无明显差异但黄体数却明显减少；影响卵巢组织结构，表现为8和12W小鼠卵巢组织结构紊乱、皮质闭锁卵泡明显可见，卵巢间质增生增厚，黄体颗粒细胞排列疏松且不规则。表明Ang基因敲除对小鼠卵巢功能有明显影响。
第二部分血管生成素基因敲除对环磷酰胺诱导卵巢早衰的影响
在第一部分证明Ang基因敲除对小鼠卵巢功能有明显影响的情况下，本部分设计试验为进一步了解Ang基因敲除对病理条件下卵巢功能是否产生影响。化疗导致的卵巢早衰(premature ovary failure, POF)或卵巢功能不全经常发生，化疗药物如环磷酰胺(cyclophosphate, CTX)等对卵巢功能的损伤近年来受到了普遍的关注，因此，对化疗药物导致卵巢功能损害的保护机制与治疗方法的研究日益显得迫切与需要。本部分用环磷酰胺对血管生成素基因敲除小鼠卵巢功能形成冲击，以观察Ang基因敲除是否会加重或者缓解POF，以进一步了解Ang基因敲除对病理条件下卵巢功能的影响，并将可能为POF诊断和治疗提供新的思路。
方法：8周龄C57BL/6J雌性小鼠分为三组：正常组(WT)，CTX组(WT＋CTX)，Ang(-/-)+CTX组，每组6只。CTX组和Ang(-/-)+CTX组小鼠均接受POF造模方法，即第一天腹腔注射负荷剂量CTX50mg.kg-1.d-1，第二天开始给予8mg.kg-1.d-1维持剂量，连续腹腔注射14天，正常组小鼠分别于对应时间腹腔注射等体积的生理盐水，期间观察记录小鼠一般状况，最后一次给药24h后所有小鼠双眼摘眼球取血，分离血清-80℃保存待测，随即脱颈处死小鼠，称量体重，剖腹，取出卵巢，称量卵巢湿重，计算卵巢指数，左侧卵巢组织固定、石蜡包埋、切片，HE染色观察卵巢形态、各级卵泡观察计数，统计占比情况；右侧卵巢组织固定、石蜡包埋，切片，采用VG染色观测各组小鼠卵巢纤维化程度。后期采用酶联免疫吸附法检测各鼠血清雌二醇(estrogen, E2)、促卵泡激素(follical-stimulating hormones, FSH)、抗苗勒氏管激素(anti-Muller tube hormones, AMH)水平。结果如下：
1、卵巢湿重及卵巢指数
1)卵巢湿重比较：正常组(0.0024±0.0004)g，CTX组(0.0010±0.0003)g，Ang(-/-)+CTX组(0.0007±0.0003)g，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组与CTX组间无显著性差异(P=0.152)。
2)卵巢重量指数比较：正常组(0.0107±0.0007)，CTX组(0.0044±0.0009)，Ang(-/-)+CTX组(0.0038±0.0017)，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组与CTX组间无显著性差异(P=0.342)。
2、各级卵泡数计数比较
1)原始卵泡数：正常组(50.13±8.79)个，CTX组(29.75±5.20)个，Ang(-/-)+CTX组(9.00±3.34)个，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组极显著低于CTX组(P<0.001)。
2)初级卵泡数：正常组(13.13±3.60)个，CTX组(9.25±2.38)个，Ang(-/-)+CTX组(4.25±1.16)个，CTX组很显著低于正常组(P=0.007)，Ang(-/-)+CTX组亦很显著低于CTX组(P=0.001)。
3)次级卵泡数：正常组(11.25±4.40)个，CTX组(8.50±2.20)个，Ang(-/-)+CTX组(4.50±1.31)个，CTX组与正常组比较无显著差别(P=0.075)，Ang(-/-)+CTX组明显低于CTX组(P=0.013)。
4)窦状卵泡数：正常组(6.63±2.07)个，CTX组(2.13±1.81)个，Ang(-/-)组(1.25±1.16)个，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组与CTX组比较无明显差异(P=0.321)。
5)闭锁卵泡数：正常组(15.75±3.45)个，CTX组(33.88±8.79)个，Ang(-/-)+CTX组(42.50±7.54)个，CTX组极显著高于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组很显著高于CTX组(P=0.002)。
6)黄体数数：正常组(7.50±2.56)个，CTX组(3.25±2.25)个，Ang(-/-)+CTX组(1.75±1.58)个，CTX组很显著低于正常组(P=0.001)，Ang(-/-)+CTX组与CTX组间无明显差异(P=0.182)。
3、总卵泡数以及各级卵泡数占比比较：
1)总卵泡数：正常组(104.38±16.03)个，CTX组(86.75±8.63)个，Ang(-/-)+CTX组(63.25.±20.41)个，CTX组很显著性低于正常组(P=0.006)，Ang(-/-)+CTX组很显著低于CTX组(P=0.001)。
2)原始卵泡数占比：正常组(47.93±2.88)%，CTX组(34.26±4.86)%，Ang(-/-)+CTX组(14.15±4.37)%，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组极显著低于CTX组(P<0.001)。
3)初级卵泡数占比：正常组(12.51±2.73)%，CTX组(10.78±3.13)%，Ang(-/-)+CTX组(6.70±1.41)%，CTX组与正常组无显著差异(P=0.188)，Ang(-/-)+CTX组很显著低于CTX组(P=0.004)。
4)次级卵泡数占比：正常组(10.63±3.28)%，CTX组(9.81±2.40)%，Ang(-/-)+CTX组(7.21±2.41)%，CTX组与正常组无显著差异(P=0.551)，Ang(-/-)+CTX组与CTX组亦无显著差异(P=0.071)。
5)窦状卵泡数占比：正常组(6.24±1.19)%，CTX组(2.52±2.15)%，Ang(-/-)+CTX组(1.87±1.71)%，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组与CTX组无显著差异(P=0.461)。
6)闭锁卵泡数占比：正常组(15.41±4.14)%，CTX组(38.76±7.79)%，Ang(-/-)+CTX组(67.21±8.79)%，CTX组明显高于正常组(P=0.022)，Ang(-/-)+CTX组极显著高于CTX组(P<0.001)。
7)黄体数占比：正常组(7.28±2.47)%，CTX组(3.87±2.99)%，Ang(-/-)+CTX组(2.86±2.81)%，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)组与CTX组无显著差异(P=0.472)。
4、性激素水平测定结果：
1)AMH：正常组(7.36±0.55)pg/ml，CTX组(2.85±0.38)pg/ml，Ang(-/-)+CTX组(1.70±0.63)pg/ml，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组极显著显著低于CTX组(P<0.001)。
2)E2：正常组(35.99±1.13)pg/ml，CTX组(23.81±1.03)pg/ml，Ang(-/-)+CTX组(18.85±1.06)pg/ml，CTX组极显著低于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组极显著低于CTX组(P<0.001)。
3)FSH：正常组(2.35±0.41)mIU/ml，CTX组(3.42±0.34)mIU/ml，Ang(-/-)+CTX组(6.08±0.33)mIU/ml，CTX组极显著高于正常组(P<0.001)，Ang(-/-)+CTX组极显著高于CTX组(P<0.001)。
5、卵巢组织学观测结果
CTX组卵巢组织较之正常组明显萎缩，组织结构紊乱，间质坏死，伴有纤维化，皮质见较多闭锁卵泡和卵泡坏死；Ang(-/-)+CTX组小鼠卵巢组织相比于CTX组更明显萎缩，组织结构紊乱明显，有大量的闭锁卵泡和大量的卵泡坏死，生长卵泡少见，间质纤维化程度明显增高。
结论：综上结果表明，C57BL/6J正常雌性小鼠经CTX处理后，与正常雌性小鼠相比，CTX组小鼠卵巢重量和卵巢指数极显著降低，卵巢组织萎缩，结构紊乱，间质坏死，皮质见较多闭锁卵泡和卵泡坏死，伴有纤维化，总卵泡数、原始、初级、窦状卵泡数均显著性下降，闭锁卵泡数显著增加，黄体数目显著下降，其中，原始卵泡、窦状卵泡和黄体占比明显下降，闭锁卵泡占比明显增加，且FSH水平显著升高，AMH和E2水平均显著降低，表明CTX诱导了明显的卵巢早衰。与CTX组相比，Ang(-/-)+CTX组小鼠卵巢组织进一步萎缩，结构更加紊乱，闭锁卵泡和卵泡坏死加重，纤维化程度加重，总卵泡数及各级生长卵泡数进一步明显减少，闭锁卵泡数明显增多，但对窦状卵泡数和黄体数影响不明显，其中原始卵泡、初级卵泡占比明显下降，闭锁卵泡占比明显增加，且FSH水平显著升高，小鼠血清AMH和E2水平均显著降低，FSH水平显著增加，表明Ang基因敲除进一步加重了CTX导致的卵巢早衰，这可能与Ang基因缺陷影响血管生成，影响原始卵泡及卵泡发育，促进卵泡闭锁，并进一步影响激素分泌，即降低AMH和E2水平，上调FSH水平有关。