论文部分内容阅读
荷叶是一种在我国广泛分布的药食同源植物,具有强抗氧化和黄嘌呤氧化酶抑制(XOI)活性,可用于兼具抗氧化、XOI活性双功能植物基食品配料的开发,是研制用以调控高尿酸血症的植物性健康食品的优质原料。由于荷叶化学成分复杂、关键活性成分未知,荷叶双功能活性成分制备方法、质控标准匮乏,荷叶基降尿酸食品加工基础理论薄弱。本文采用多种方式制备荷叶提取物,评价其超氧阴离子清除(OS)和XOI活性,并全面剖析其化学组成,实现了荷叶提取物的精准分类,确定了兼具OS和XOI活性的荷叶提取物食品配料的最佳制备方式;筛选出双功能荷叶提取物的质量控制指标;预测了双功能荷叶提取物调控高尿酸血症的作用靶点及起效途径;深入探究了荷叶生物碱和类黄酮抑制黄嘌呤氧化酶(XO)作用机制及其相互作用对XOI活性的影响。研究结果不仅为性能稳定的双功能荷叶提取物的工业化批量制造提供方法指导,为荷叶基降尿酸食品开发提供有效策略,还可为新型XO抑制剂的开发、多因子降尿酸功能食品配料的精准制备提供理论支持。主要研究结果如下:(1)将超声辅助提取、回流提取、常温浸提和酶法-超声辅助提取方式与12种溶剂进行结合,制备得到35种荷叶提取物,评价了荷叶提取物的OS和XOI活性,确定了50%乙醇耦合酶法-超声辅助提取是制备双功能荷叶提取物食品配料的最佳提取方法。通过UPLC-MS/MS定性、定量分析31种荷叶提取物中的生物碱和类黄酮,共计鉴定出17种生物碱和23种类黄酮,其中橙皮素为首次在荷叶中鉴定。基于OS和XOI活性以及化学组成实现了荷叶提取物的精准分类,筛选出27种富含特征性化合物的代表性荷叶提取物。荷叶提取物中生物碱组成的主要影响因素为提取溶剂,而提取溶剂和酶法-超声辅助提取均能影响荷叶提取物的类黄酮组成。采用50%甲醇/50%乙醇/50%丙酮耦合酶法-超声辅助提取法制备得到的荷叶提取物化学组成相似,均含有12种特征性生物碱以及高含量的类黄酮糖苷、苷元,具备强OS和XOI活性。(2)从27种代表性荷叶提取物中筛选出化学组成各有特色,OS、XOI活性强弱不同的4种典型荷叶提取物作为研究对象,构建重组模型探究特征性化合物对活性的贡献程度,结果表明类黄酮对含丰富类黄酮的典型荷叶提取物发挥OS活性有重要贡献,而生物碱对OS活性几乎没有贡献;生物碱和类黄酮对于典型荷叶提取物发挥XOI活性均有着重要作用;生物碱和类黄酮的交互作用会明显影响典型荷叶提取物的OS和XOI活性。在此基础上,通过缺失实验筛选出双功能荷叶提取物食品配料的质量控制指标为:去甲基乌药碱、O-去甲基荷叶碱、N-去甲基荷叶碱、荷叶碱、木犀草素、香叶木素、槲皮素和槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷。基于网络药理学探究了50%乙醇耦合酶法-超声辅助提取法制备得到的双功能荷叶提取物对高尿酸血症的干预途径,结果表明该提取物可以通过干预尿酸的合成与转运、炎症反应、氧化应激和脂质代谢等途径来改善高尿酸血症及其并发症。(3)测定荷叶中5种苄基异喹啉类生物碱、6种阿朴啡类生物碱和1种类黄酮(香叶木素)的XOI活性,其中香叶木素为XOI活性最强的化合物,去甲基乌药碱和N-去甲基荷叶碱分别是XOI活性最强的苄基异喹啉类生物碱和阿朴啡类生物碱;苄基异喹啉类生物碱的XOI活性与C-6/7上甲氧基/羟基的取代、N-2上甲基/氢原子的取代有密切关系,阿朴啡类生物碱的XOI活性与C-2上甲氧基/羟基的取代、N-6上甲基/氢原子的取代有密切关系。通过XO抑制类型的评价、荧光猝灭和分子对接进一步探究了荷叶生物碱和香叶木素对XO的抑制机制,结果表明去甲基乌药碱、杏黄罂粟碱、N-去甲基荷叶碱、荷叶碱均为XO的混合性抑制剂,可部分进入XO的活性中心,与XO形成复合物;香叶木素为XO的竞争性抑制剂,可进入XO的活性中心,与XO形成复合物;这五种化合物与XO均只有1个结合位点,与XO催化位点处Leu648、Phe649、Val1011、Phe1013等氨基酸残基发生相互作用。采用CI联用指数评价了化合物之间的交互作用,当去甲基乌药碱、杏黄罂粟碱、N-去甲基荷叶碱、荷叶碱和香叶木素的摩尔配比为7:21:147:49:32时,在XOI率小于85%的情况下,协同效果最佳。