非洲爪蟾APRIL及犬LIGHT、HVEM的克隆、表达及生物学活性研究

来源 :南京师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:collinne
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本论文共分为两个大部分:第一部分非洲爪蟾增殖诱导配体APRIL的相关研究。本研究通过RT-PCR和RACE技术成功克隆了非洲爪蟾的增殖诱导配体(XlAPRIL)基因的全长序列,并进行了结构及功能上的鉴定。全长一共1504bp,其中包括91bp的5’端非编码区、714bp的3’端非编码区和699bp的开放阅读框(编码232个氨基酸)。通过序列比对发现,非洲爪蟾的APRIL含有两个保守的半胱氨酸残基(Cys178and Cys193)、弗林酶切位点和TNF典型结构域。Blast分析表明,跟已知物种的APRIL序列比对,胞外段的同源性比全长的同源性高,说明受体结合区域的保守性更高。荧光定量PCR结果显示非洲爪蟾的增殖诱导配体在脾脏中高表达。通过采用与SUMO融合表达的方法,在Rosseta菌中通过Ni柱亲和层析制备到大量可溶重组APRIL蛋白,并经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫转印检测(Western blotting)鉴定。体外WST-8测活实验结果显示非洲爪蟾APRIL对爪蟾淋巴细胞和小鼠的B细胞均具有促增殖/存活的作用。第二部分犬LIGHT及其受体HVEM的相关研究。鉴于两者对于免疫调节的重要作用,本文选择犬作为研究对象,从犬的脾脏组织中通过RT-PCR的方法分别扩增得到开放阅读框为723bp的LIGHT基因和819bp的HVEM基因,并对这两个基因进行了一系列的生物信息学分析,结果表明犬LIGHT蛋白是典型的Ⅱ型跨膜蛋白,而HVEM蛋白为典型的Ⅰ型跨膜蛋白。组织定量分析发现LIGHT和HVEM的mRNA在很多的组织中都有表达,但是在脾脏中的相对表达量都是最高的。通过基因工程手段,分别构建了pET43.1a-dsLIGHT和pET28a-dsHVEM重组载体,通过原核表达,金属亲和层析的方法在体外获得了相应的可溶性蛋白,并对其生物学功能进行了初步探索。通过激光共聚焦显示两个基因在T细胞表面的结合,通过软件模拟显示两个基因3D结构的结合。
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