脂联素对内皮祖细胞增殖、迁移和成管的影响

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背景:脂联素(adiponectin,APN)对缺血性心脑血管疾病具有保护作用。脂联素通过保护内皮细胞功能、促进血管新生、减轻炎症反应等促进脑缺血后神经功能恢复。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)具有干细胞增殖分化的能力,可以参与内皮细胞成管,促进血管新生和缺血后的血管新生。目前尚未有利用内皮祖细胞联合脂联素转基因治疗脑缺血的研究,我们设想将脂联素与内皮祖细胞联合治疗,观察对脑缺血神经功能恢复的影响。本实验旨在研究脂联素对内皮祖细胞增殖、迁移、成管等血管新生相关功能的影响。方法:(1)采用脐带血分离单核细胞方式分离培养内皮祖细胞,并鉴定。(2)构建携带脂联素基因的慢病毒(lentivirus-GFP-APN)以及携带绿色荧光的对照病毒(lentivirus-GFP),使用慢病毒转染内皮祖细胞,构建APN-EPC和GFP-EPC稳转株,并鉴定转染后脂联素的表达。(3)采用CCK8试剂盒检测并比较APN-EPC和GFP-EPC的增殖能力,采用划痕实验和transwell检测并比较APN-EPC和GFP-EPC的迁移能力,检测APN-EPC和GFP-EPC体外成管能力。结果:(1)采用单核细胞分离方式从脐带血中分离的内皮祖细胞经鉴定符合国际上对内皮祖细胞的定义,培养的内皮祖细胞具有增殖、分化等干细胞的功能,同时具有内皮细胞体外成管功能。(2)携带脂联素基因的慢病毒转染内皮祖细胞后可以稳定表达脂联素和绿色荧光蛋白,并且可以随着增殖传代稳定低传给后代。(3)A:CCK8检测脂联素增殖:GFP-EPC组OD值小于APN-EPC组(GFP-EPC组OD值=0.56±0.04,APN-EPC组OD值=0.81±0.36,N=5,P=0.001);B:划痕实验显示:GFP-EPC组5h细胞迁移面积小于APN-EPC组(GFP-EPC组迁移率:15.58%±4%,APN-EPC组迁移率:23.71%±1%,N=5,P=0.002);C:transwell实验:平均每个高倍镜视野(10X)迁移细胞GFP-EPC组小于APN-EPC组(GFP-EPC组每高倍镜视野迁移细胞数:19.33±2.24,APN-EPC组每高倍镜视野迁移细胞数:43.07±1.224,N=3,P=0.001);D:成管实验:5h:APN-EPC组成管长度是GFP-EPC组的1.36倍,P=0.001,24h APN-EPC组成管长度是GFP-EPC组的1.34倍,P=0.01。结论:(1)成功实现内皮祖细胞体外培养和传代。(2)脂联素可以促进内皮祖细胞的增殖、迁移和体外成管能力。
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