第一部分GLUT4、PPP1Cgamma表达在肝硬化病人胰岛素抵抗中的作用序言:肝硬化病人60%～80%可发生糖耐量异常,10%～20%可最终发展为糖尿病。其相关的发生机制尚不清楚,目前认为可能与高胰岛素血症和外周组织的胰岛素抵抗有关。胰岛素抵抗即指肝脏、骨骼肌、脂肪等组织对胰岛素作用的敏感性下降,胰岛素效应细胞对单位浓度的胰岛素反应减弱。胰岛素在细胞水平的生物作用是通过与靶细胞膜上特异的胰岛素受体(InsR)结合而启动胰岛素一系列信号传导通路,最终使胰岛素敏感组织细胞内葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)转位到细胞表面,把细胞外的葡萄糖转运到细胞内,进行糖原的合成、氧化分解,并抑制糖内生等一系列代谢过程,使血糖维持在正常水平。被GLUT4转运到细胞内的葡萄糖主要经1型蛋白磷酸酶(PP1)途径合成糖原,PP1是胰岛素激活糖原合成酶途径中的主要磷酸酶,是由调节亚单位和催化亚单位组成的异二聚体。调节亚单位与骨骼肌糖原有高度亲和力,能正性调节催化亚单位的去磷酸化作用,并激活糖原合成酶并合成糖原。研究认为GLUT4在葡萄糖的吸收和利用上起了关键限速作用,GLUT4的表达下降或转位障碍将引起胰岛素抵抗。由PPP1R3A基因所编码的PP1调节亚单位的缺失也将导致糖原合成酶活性的急剧下降,使得骨骼肌糖原含量减少,并产生胰岛素的抵抗。研究认为肝硬化病人胰岛素抵抗主要表现为葡萄糖的摄取减少和非氧化处置(糖原合成)减少,主要是肌糖原合成功能下降。目前有关GLUT4与肝硬化胰岛素抵抗研究还很少,编码PP1催化亚单位的PPP1Cgamma表达与胰岛素抵抗的研究尚未见报道。目前在我国接受肝移植手术的患者主要是重症乙肝肝硬化病人。为进一步研究GLUT4、PPP1Cgamma表达在肝移植病人围术期胰岛素抵抗中的作用,我们将首先研究GLUT4、PPP1Cgamma表达在肝硬化病人胰岛素抵抗中的作用。本课题一方面通过检测比较正常人、代偿期肝硬化病人和失代偿期肝硬化病人的空腹血糖、胰岛素、C肽、胰岛素敏感性来研究不同程度肝硬化病人的胰岛素抵抗现象,另一方面通过检测并比较正常人、代偿期肝硬化病人和失代偿期肝硬化病人腹直肌GLUT4、PPP1Cgamma基因及其蛋白表达量,来研究GLUT4、PPP1Cgamma表达在肝硬化胰岛素抵抗中的作用,为临床进一步研究肝移植围术期胰岛素抵抗及肝移植后糖尿病提供基础。资料与方法:研究对象分为三组,即正常对照组、肝硬化代偿组和肝硬化失代偿组。正常对照组:活体肝或肾移植供体25例,肝功能Child-Pugh分级均为A级;肝硬化代偿组:乙肝肝硬化作脾脏切除术的患者17例,肝功能Child-Pugh分级均为A级;肝硬化失代偿组:重症乙肝肝硬化作肝移植的患者20例,肝功能Child-Pugh分级C级12例,B级8例。三组研究对象均在麻醉前从桡动脉有创测压管采外周血6ml,用快速血糖仪检测空腹血糖,用化学发光免疫分析法测定空腹胰岛素和C肽。并用计算出胰岛素敏感指数:公式为ln[1/(空腹血糖×空腹胰岛素)]。并在手术进腹时取腹直肌适量,并切成50～100mg数块,用液氮速冻后置于-80℃超低温冰箱中待测。用Western-blot法检测腹直肌GLUT4、PPP1Cgamma蛋白表达量,以real-time PCR方法检测腹直肌PPP1Cgamma mRNA的表达。统计分析所有实验数据经SPSS16.0软件进行统计学处理,p<0.05判定有统计学差异。结果:两组肝硬化病人的空腹血糖都明显高于正常组(P<0.01),肝硬化代偿组与肝硬化失代偿组间空腹血糖无明显差异。两组肝硬化病人的空腹血胰岛素水平都明显明显高于正常组(P<0.01),且肝硬化失代偿组的血胰岛素水平也高于肝硬化代偿组,差异有显著性(P<0.05)。两组肝硬化病人的血C-肽水平都明显高于正常组(P<0.01),且肝硬化失代偿组的血C-肽水平也明显高于肝硬化代偿组,有显著差异(P<0.01)。两组肝硬化病人的胰岛素敏感指数都明显低于正常组(P<0.01),肝硬化失代偿组的胰岛素敏感指数虽然低于肝硬化代偿组,但无统计学差异。两组肝硬化组病人骨骼肌GLUT4的蛋白表达量与正常对照组无明显差别,肝硬化失代偿组GLUT4的蛋白表达量与代偿组也无差别。两组肝硬化病人骨骼肌PPP1Cgamma mRNA和蛋白表达量均显著低于正常对照组,差异有非常显著性(P<0.01),两组肝硬化病人组间无明显差别。结论:(1)肝硬化病人存在糖代谢异常与胰岛素抵抗;(2)肝硬化病人的胰岛素抵抗与其骨骼肌GLUT4的表达无明显相关;(3)肝硬化病人骨骼肌PP1的催化亚单位PPP1Cgamma mRNA和蛋白的含量明显减少,可能是形成肝硬化病人胰岛素抵抗的原因之一。序言:肝移植是目前治疗终末期肝病的最有效方法。肝移植手术创伤大、失血多,时间长,术中内环境变化剧烈,严重威胁病人的生命。其中一个重要的内环境变化是病人围术期血糖的升高及严重的胰岛素抵抗现象。肝移植围术期高血糖、胰岛素抵抗可导致患者水、电解质、酸碱平衡的紊乱,甚至出现高渗性昏迷;也是肝移植患者术后出现认知功能障碍的原因之一;更是肝移植术后病人早期感染的危险因子。从长期来看,肝移植手术病人围术期高血糖、胰岛素抵抗现象可发展成肝移植后糖尿病并严重影响肝移植后病人的长期生存。胰岛素抵抗即指肝脏、骨骼肌及脂肪等组织对胰岛素作用的敏感性下降,胰岛素效应细胞对单位浓度的胰岛素反应减弱。胰岛素在细胞水平的生物作用是通过与靶细胞膜上特异的胰岛素受体结合而启动胰岛素一系列信号转导通路,最终使胰岛素敏感组织细胞内葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)转位到细胞表面,GLUT4把细胞外的葡萄糖转运到细胞内,并进行一系列的代谢过程,使血糖维持在正常水平。GLUT-4在葡萄糖的吸收和利用上起了关键限速作用,GLUT-4的表达下降或转位障碍与2型糖尿病和胰岛素抵抗有关。被GLUT4转运到细胞内的葡萄糖主要通过1型蛋白磷酸酶(glycogen-bound Protein phosphatase1,PP1)途径合成糖原。PP1是胰岛素激活糖原合成酶途径中的主要磷酸酶,由催化亚单位和调节亚单位构成。PP1的调节亚单位具有底物特异性,且能正性调节催化亚单位的去磷酸化作用,使糖原合成酶去磷酸化而被激活,并进一步合成糖原。GLUT4在葡萄糖的吸收和利用上起了关键限速作用,GLUT4的表达下降或转位障碍与2型糖尿病和胰岛素抵抗有关。编码PP1调节亚单位的PPP1R3的突变或表达量下调也将严重影响血糖水平并产生胰岛素的抵抗。有关GLUT4和PP1催化亚单位PPP1Cgamma表达变化与肝移植病人胰岛素抵抗的研究还尚未见报道。目前临床上胰岛素抵抗的研究主要集中在2型糖尿病病人,而有关肝移植病人围术期胰岛素抵抗的研究还很少。尽管国内外学者已对肝移植围术期高血糖、胰岛素抵抗这一现象进行了关注和研究,但主要还是集中在肝移植围术期糖代谢相关激素的研究上,且分歧很大。我们第一部分的研究已经显示肝硬化肝移植的病人在移植前就存在肝硬化相关的胰岛素抵抗及骨骼肌PPP1Cgamma基因及其蛋白表达量的下降,这可能是肝移植病人围术期胰岛素抵抗的原因之一,本课题拟进一步通过比较肝移植前后患者血糖、胰岛素、C肽、胰岛素敏感性来研究肝移植手术对患者胰岛素敏感性的影响,并通过检测比较肝移植手术前后腹直肌GLUT4、PPP1Cgamma基因及其蛋白表达量的变化,来研究肝移植手术对患者GLUT4、PPP1Cgamma表达的影响及其在肝移植围术期胰岛素抵抗中的作用。资料与方法:所有研究对象均来自2007年1～12月我院因重症乙肝肝硬化作原位肝移植手术的患者,共20例,其中男性19例,女性1例,年龄为21～60(50.55±13.28)岁,体重为36～95(64.03±11.62)kg,肝功能Child-Pugh分级B级8例,C级12例。在入手术室后麻醉前、门静脉开放后即刻、开放后半小时、1小时、2小时等各时间点从桡动脉有创测压管采患者外周血6ml,用快速血糖仪检测空腹血糖,用化学发光免疫分析法测定空腹胰岛素和C肽。并用计算出胰岛素敏感指数:公式为ln[1/(空腹血糖×空腹胰岛素)]。并在肝移植手术进腹时、在门静脉开放后半小时取腹直肌适量,用Western-blot法检测腹直肌GLUT4、PPP1Cgamma蛋白表达,以real-time PCR方法检测腹直肌PPP1Cgamma mRNA的表达。所有实验数据经SPSS16.0软件进行统计学处理,p<0.05判定有统计学差异。结果:1.血标本结果门静脉开放后各时间点的血糖值均较术前显著升高,且差异有显著性,P值均小于0.01;开放半小时后的各时间点的血糖值均较开放即刻明显升高,差异有显著性,P值均小于0.05;虽然门静脉开放后各时间点的血胰岛素值高于移植前,但均无统计学差异。肝移植术后患者的血C-肽值较术前有下降趋势,但无统计学差异。胰岛素敏感指数在新肝期即刻明显低于术前,P<0.01;开放后半小时和开放后一小时的胰岛素敏感指数均较术前降低,P<0.05。但开放后两小时胰岛素敏感指数虽然也低于移植前,但无统计学差异。其余各组间均无明显差异。2.骨骼肌组织Western-blot结果肝移植手术前、后患者骨骼肌GLUT4蛋白表达量无显著差异。肝移植手术前、后患者骨骼肌PPP1Cgamma蛋白表达量也无显著差异。3.骨骼肌组织Real-time PCR结果:肝移植手术前、后患者骨骼肌PPP1Cgamma mRNA的表达无明显差别。结论:肝移植手术后患者存在较术前更严重的胰岛素抵抗;肝移植手术前后骨骼肌GLUT4、PPP1Cgamma的表达无显著变化;肝移植手术患者围术胰岛素抵抗除与其术前存在的肝硬化相关的胰岛素敏感性下降、PPP1Cgamma表达下降有关外,还与肝移植手术相关的其他因素有关。