高致病性禽流感(High pathogenic avain influenza, HPAI)在全球范围的爆发和蔓延引起了世界各国的高度关注。为了有效防控HPAI,国际上主要采取隔离封锁疫点,扑杀销毁感染动物和受威胁动物,以及其他生物安全措施,许多发达国家和地区采用上述措施,扑灭了爆发的HPAI疫情。但当疫情面临大面积扩散,以上措施难以奏效、巨大经济损失难以承担时,免疫接种就成了控制疫情的关键措施之一。我们国家采取以禽流感疫苗免疫接种为主的综合防制措施。高致病性禽流感疫苗被纳入国家强制免疫品种,由农业部指定8家禽流感定点企业生产,执行政府招标采购制度。国家对于禽流感疫苗的研发、生产、销售、使用实施严格的监管措施,禽流感疫苗的质量受到了政府、生产企业、养殖户的高度关注。本研究正是在上述背景下,在执行第四届兽药典委员会下达的“注射用白油质量标准及检测规范”、“黏度计替代吸管法检测黏度标准及方法研究”两项项目基础上,以影响禽流感疫苗质量的三个关键因素种蛋、注射用白油、黏度标准的研究和制定为主线,针对禽流感疫苗原辅材料质量、生产工艺、质量检验、市场应用等关键环节中的质量控制点进行系统研究,以解决当前禽流感疫苗在安全、高效、稳定、均一方面存在的问题,同时制定与国际接轨的行业及国家标准,以全面提升我国禽流感疫苗的质量水平,满足国际、国内市场的需求。本研究内容分为三个主要部分：1禽流感病毒(AIV)增殖方法及生产用种蛋质量控制在不同种蛋母源抗体水平下,采用矩阵方法对AIV最佳接种稀释度、最佳接种胚龄进行研究,结果显示采用母源抗体≤21og2的禽流感非免疫种蛋,病毒最佳稀释度为1:10000(104EID50/0.1mL),最佳接种胚龄为10日龄,每胚收获量达到12.5mL,平均HA效价为11log2,病毒EIDs0为108.5EID50/0.1mL;采用母源抗体≤6log2的禽流感低免疫种蛋,病毒最佳稀释度为1:10000(104EID50/0.1mL),最佳接种胚龄为10日龄,每胚收获量达到12.8mL,但平均HA效价为10log2,病毒EID50为107.3EID50/0.1ml;采用母源抗体≤8log2的禽流感高免疫种蛋,病毒最佳稀释度为1:1000(105EID50/0.1mL),最佳接种胚龄为10日龄,每胚收获量达到12mL,但平均HA效价为9log2,病毒EID50为107.6EID50/0.1mL,同期比较的SPF鸡胚每胚收获量达到13mL,平均HA效价为12log2,病毒EID50为108.8EID50/0.1mL,为保证实验的准确性,所有鸡胚的接种和收获均采用自动接种收获机进行。综合分析以上试验数据,我们选择将AIV1:10000(104EID50/0.1mL)倍稀释,接种10日龄非免疫鸡胚(母源抗体≤2log2)为最佳病毒增殖条件。按照以上病毒增殖最佳条件,我们选择了国内14家主要禽流感灭活疫苗种蛋供应商提供的非免疫种蛋230万枚,生产重组AIV灭活疫苗14批共计5445万毫升。通过14批非免疫种蛋外观、重量、破损率、受精率、死胚率、利用率、每胚收获量统计,建立生产用种蛋内控质量标准。14批种蛋外观清洁、通过选蛋机保证蛋大小均匀、蛋重在50-60g之间,14批种蛋中,破损率在2%以下的有10批,受精率均在91%以上,接种前死胚率在4%以下的有11批,接种前种蛋利用率在85%以上的有8批。综合评价病毒接种后死胚率、每胚收获量、病毒效价指标,9批为接种后死胚率在10%以下,病毒每胚收获量在10mL以上、病毒效价在10log2以上,按照以上种蛋质量指标生产的禽流感疫苗14批中有11批HI平均抗体效价达到了8log2,高于禽流感疫苗成品效力检验6log2的指标,说明种蛋各项指标较为合理,能够有效保证产品质量。2注射用白油质量标准及操作规范研究选择国内禽流感定点企业普遍使用的一种进口白油MC及两种不同黏度国产白油LH、HZ,采用《中华人民共和国兽药典》(2005版)“注射用白油质量标准”及“食品级白油质量标准”(GB48532008)进行全项检测,三种来源白油在运动黏度、稠环芳烃含量、碳数分布方面存在差异,其中4组LH来源白油运动黏度、稠环芳烃含量最低,碳数分布最窄,各组分清晰,三种指标分别为4.37-5.7mm2/s、0.005-0.015、15-19; MC来源白油三种指标为7.26mm2/s、0.162、15-24; HZ来源白油三种指标为11.16mm2/S、0.037、15-24。用这三类白油制备成油乳疫苗后在SPF鸡体做了比较试验。从安全性试验结果看,疫苗吸收状况存在一定的个体差异。采用胸部肌肉途径接种后,吸收最好的运动黏度为5.7mm2/S的LH白油组,在免疫后48天基本吸收,其次为HZ组,48天后有1只鸡局部有少量未吸收干酪物。稠环芳烃含量超标的MC组,局部炎性反应严重,吸收稍差。从效力检验指标看,LH来源4组白油制备的AI疫苗诱生的HI抗体效价全部高于进口的MC及国产HZ来源白油,疫苗免疫2周后HI抗体效价即能达到7.6log2,三周达到9.5log2。从免疫保存期及持续期数据看,用LH白油批量生产的ZSLHAI疫苗免疫后产生的HI抗体显著高于ZSMC、ZSHZ疫苗,免疫130天后,HI抗体仍然维持在9.4log2,保存12个月,ZSLH疫苗抗体效价维持在8.51og2,而保存9个月时,ZSMC、ZSHZ疫苗已达不到成品效力检验6log2的标准。从不同品种鸡鸭免疫保护效力试验数据看,免疫7日龄商品肉鸡,免疫后28天,ZSLH疫苗抗体效价为7.81og2, ZSMC疫苗为6.71og2, ZSHZ疫苗为6.1log2；免疫18日龄蛋雏鸡,免疫后38天达到抗体高峰,ZSLH疫苗为8.21og2, ZSMC疫苗为7.0log2,ZSHZ疫苗为6.9log2；免疫18周龄蛋种鸡,免疫后1个月达到抗体峰值,ZSLH疫苗为10.8log2,ZSMC疫苗为9.91og2, ZSHZ疫苗为8.2log2；免疫10日龄商品肉鸭,一次免疫4周达到抗体峰值,ZSLH疫苗为7.11og2, ZSMC疫苗为5.41og2, ZSHZ疫苗为5.2log2；3周龄加强免疫后,在第5周达到抗体峰值,ZSLH疫苗为9.31og2, ZSMC疫苗为8.31og2, ZSHZ疫苗为7.9log2；免疫14日龄易感蛋鸭,一次免疫ZSLH疫苗5周达到抗体峰值,为8.51og2, ZSMC. ZSHZ疫苗免疫4周达到峰值,分别为5.31og2,5.11og2;3周龄加强免疫后,在第6周达到抗体峰值,ZSLH疫苗为10.81og2, ZSMC疫苗为9.41og2, ZSHZ疫苗为9.1log2。综合分析,低黏度、低稠环芳烃含量、高纯度的国产LH白油安全性及免疫保护效力均优于进口和国产同类产品。3黏度计替代吸管法检测禽流感灭活疫苗黏度研究研究发现,佐剂黏度是影响疫苗黏度的重要因素,在不改变生产工艺、配方的情况下,黏度范围为4.3-5.0mm2/s的LH来源白油制备的疫苗黏度最低,在40mPa.s以下,黏度范围为7.31-7.42mm2/s的MC来源白油制备的疫苗黏度在109mPa.s以内,黏度范围为8.48-11.29mm2/s的HZ来源白油制备的疫苗黏度最高为166mPa.s以内。通过改变佐剂黏度可显著降低疫苗黏度。工艺配方也是影响禽流感灭活疫苗黏度的重要因素,在佐剂不变的情况下,采用水相：油相1：3的配方,加硬脂酸铝,疫苗黏度不高于60mPa.s;采用水相：油相1：3的配方,不加硬脂酸铝,疫苗黏度不高于40mPa.s;采用水相：油相1：1.5的配方加硬脂酸铝,疫苗黏度最高,达到165mPa.s,采用水相：油相1：1.5的配方不加硬脂酸铝,疫苗黏度达到119mPa.s。不同禽流感疫苗生产企业生产相同品种的禽流感疫苗黏度存在差异,最低的为18.7mPa.s,最高的为91mPa.s,差异极显著,8个来源的相同品种疫苗中,有6个黏度在60mPa.s以下。综合统计所有品种禽流感疫苗黏度,60%产品黏度在60mPa.s以下,因此将禽流感灭活疫苗黏度企业内控标准定为不高于60mPa.s。以44对刻度吸管及黏度计检测数据建立油乳剂疫苗黏度检测刻度吸管法和黏度计法的回归模型,通过回归关系方差分析表证明刻度吸管法与黏度计法检测疫苗黏度有极显著的回归关系。本研究得出以下结论：(1)原辅材料质量是影响禽流感疫苗质量的关键因素,通过建立生产用种蛋内控质量标准及注射用白油质量标准,可保证禽流感疫苗的安全、稳定、高效、均一；(2)采用低黏度、低稠环芳烃、高纯度白油制备禽流感疫苗可在确保安全性的前提下显著提高疫苗免疫效价、延长免疫持续期,减少免疫次数并保证疫苗有效期内的抗原稳定性；(3)采用黏度计替代刻度吸管法检测疫苗黏度更加精确,并能够与国际接轨。在禽流感疫苗工艺研究中,佐剂黏度及工艺配方是影响疫苗黏度的重要因素。